第一部分 引言药物或感染所致急性心脏毒性严重威胁相关患者的健康。研究发现,阿霉素或脂多糖所致的急性心肌毒性均涉及自噬。自噬是机体的一种自我更新机制。根据其对机体产生的作用可分为依赖自噬的细胞死亡和适应性自噬。在一些急性损伤前诱导适应性自噬,可取得较好的保护效果。研究证实,14-3-3γ和PKCε是内源性保护蛋白,并且14-3-3γ可影响自噬相关环节。葛根素是从葛根中分离得到的一种生物活性成分。它具有多种药理作用,已经广泛应用于心血管疾病的治疗和辅助治疗。本研究团队前期研究发现,葛根素和槲皮素均可上调PKCε的表达和磷酸化,保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤。因此,本研究在前期工作基础上旨在探讨（1）葛根素对阿霉素或脂多糖所致急性心肌毒性有保护作用;（2）葛根素的保护作用可能与14-3-3 γ/PKCε通路有关;（3）葛根素上调14-3-3γ的表达、促进PKCε的相互作用,并帮助PKCε向线粒体迁移,从而保护心肌免受急性毒性损伤;（4）葛根素可能通过14-3-3 γ/PKCε通路并激活适应性自噬来实现对急性心肌毒性损伤的保护;（5）葛根素的作用可能分别与抑制过度氧化应激、改善线粒体功能以及抗炎有关。第二部分 葛根素对阿霉素诱导H9c2细胞急性心肌毒性的保护作用目的:确定葛根素对阿霉素诱导H9c2细胞急性心肌毒性保护作用的机制方法:用不同剂量葛根素预处理阿霉素损伤H9c2心肌样细胞、实验涉及的相关处理因素单独对H9c2心肌样细胞进行处理,使用CCK-8、LDH试剂盒检测H9c2心肌样细胞的细胞存活率、LDH活性。在无葛根素存在的情况下,观察抑制14-3-3γ、PKCε的表达或者适应性自噬对阿霉素诱导的急性心肌毒性是否有加重现象。采用pAD-14-3-3γ-shRNA腺病毒载体、PKCε抑制剂εV1-2、自噬抑制剂3-MA以抑制14-3-3γ、PKCε或适应性自噬,再经葛根素预处理及阿霉素损伤,检测细胞存活率、LDH,以观察葛根素预处理对H9c2心肌样细胞的保护作用是否与14-3-3γ、PKCε表达或适应性自噬有关。结果:H9c2心肌样细胞在阿霉素处理之前经40μM、80μM、160μM、320μM的Pue进行预处理后,与阿霉素处理组相比,细胞存活率升高（p＜0.01）,LDH活性显著降低（p＜0.01）。葛根素浓度为80μM及160μM组与初始浓度（40μM）相比,细胞存活率明显升高（p＜0.05）,LDH活性显著降低（p＜0.05）,存在明显差异。葛根素单独作用、pAD/14-3-3γ-shRNA组、葛根素+εV1-2组、葛根素+3-MA组细胞的存活率、乳酸脱氢酶活性与对照组相比,无显著差异。而pAD/14-3-3γ-shRNA、εV1-2和3-MA单独作用下的细胞存活率均低于对照组、乳酸脱氢酶活性均高于对照组。在没有葛根素干预的情况下,下调14-3-3γ或PKCε的表达,或者抑制适应性自噬,均可导致阿霉素对H9c2细胞的损伤加重。葛根素能够有效的降低阿霉素对H9c2心肌样细胞损伤所造成的细胞死亡率及LDH活性,抑制因阿霉素所致的细胞凋亡,降低caspase-3活性。当加入pAD/14-3-3γ-shRNA或者PKCε特异性抑制剂εV1-2,葛根素产生的上述所有保护作用几乎完全被取消。结论:（1）将在进行阿霉素损伤前24h加入80μM葛根素为保护作用具有统计意义的最低浓度,并在后续实验中涉及葛根素预处理的实验分组均采用此浓度进行操作。（2）葛根素对H9c2细胞正常功能无显著影响,14-3-3γ的表达、PKCε活性和适应性自噬在保障H9c2细胞的正常功能中起重要作用。（3）在无葛根素预处理的情况下,抑制14-3-3γ或PKCε的表达,或者抑制适应性自噬,均可使阿霉素诱导的急性心肌毒性加重（4）葛根素预处理H9c2心肌样细胞,可减少阿霉素诱导的心脏毒性所引起的细胞死亡、LDH活性升高,抑制因阿霉素而引起的细胞凋亡。而上述保护作用与14-3-3γ、PKCε表达或适应性自噬有关。第三部分 葛根素上调14-3-3γ/PKCε激活适应性自噬保护H9c2细胞免受阿霉素急性毒性损伤目的:观察葛根素是否能够上调14-3-3γ/PKCε表达和促进PKCε向线粒体迁移,并激活适应性自噬,确认14-3-3γ与PKCε之间是否存在相互作用。方法:采用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ的表达,用PKCε特异性抑制剂εV1-2抑制PKCε的活性,用葛根素预处理阿霉素损伤H9c2心肌样细胞,用免疫印迹法来检测细胞及线粒体中相关蛋白的表达,用LysoTracker探针检测细胞内溶酶体酸化水平来进一步确认14-3-3γ/PKCε与适应性自噬的关系;用免疫共沉淀法来确认14-3-3γ与PKCε之间是否存在相互作用等方法进一步探索葛根素保护H9c2细胞免受阿霉素急性毒性损伤的机制。结果:葛根素可上调细胞中14-3-3γ、PKCε的表达,促进PKCε向线粒体迁移。当加入pAD/14-3-3γ-shRNA或者PKCε特异性抑制剂εV1-2,上述所有作用几乎完全被取消。当使用3-MA抑制自噬产生时,即使事先使用葛根素进行预处理,阿霉素损伤的细胞也出现明显的细胞存活率下降、LDH活性升高。经阿霉素损伤的细胞自噬被明显抑制,不能被激活,表现为自噬标志物LC3-Ⅱ升高不显著而P62明显升高,细胞内溶酶体虽略有增加,但增加不明显。当使用葛根素进行预处理后,自噬被激活,表现为与阿霉素损伤组比较,自噬标志物LC3-Ⅱ显著升高而P62显著降低;这一表现在加入3-MA抑制了适应性自噬而被取消。结论:葛根素可促进14-3-3γ和PKCε的表达、激活14-3-3 γ/PKCε通路、同时促进14-3-3γ与PKCε相互结合,并促使后者磷酸化且向线粒体转移,同时激活适应性自噬,从而可能对抗阿霉素所致心肌损伤。第四部分 葛根素预处理对阿霉素损伤H9c2细胞线粒体功能及氧化应激作用等的影响目的:观察葛根素预处理对线粒体的保护作用及抗氧化应激作用,以及该作用的产生是否能与14-3-3γ/PKCε通路激活有关。方法:葛根素预处理H9c2细胞,并采用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ表达,再经阿霉素损伤,观察细胞ROS生成、SOD、GSH-Px、CAT、MDA等生化指标,并检测线粒体膜电位、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放、细胞氧消耗速率（OCR）、胞外酸化速率（ECAR）等。结果:使用葛根素预处理H9c2细胞,能有效的抑制阿霉素对H9c2心肌样细胞损伤引起ROS和MDA的产生,明显提高SOD、GSH-Px、CAT的活性。当加入pAD/14-3-3γ-shRNA或者PKCε特异性抑制剂εV1-2,葛根素产生的上述所有保护作用几乎完全被取消。H9c2心肌样细胞经阿霉素损伤后,线粒体膜电位降低、线粒体通透性转换孔开放增加,同时线粒体呼吸链活性被抑制,表现为ATP生成减少,能量代谢紊乱。当使用葛根素进行预处理后,线粒体膜电位明显上升,线粒体通透性转换孔开放减少。但如果使用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ生成,则线粒体的功能仍将受到抑制和破坏。与此相似,H9c2心肌样细胞遭受阿霉素损伤后,糖酵解供能途径被激活,糖酵解速率极速上升。当使用葛根素进行预处理后,糖酵解速率明显下降。但如果使用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ生成,即使有葛根素的存在,糖酵解速率上升仍十分明显。结论:（1）葛根素预处理H9c2心肌样细胞,可减少阿霉素诱导的心脏毒性所引起ROS和MDA的产生,明显提高SOD、GSH-Px、CAT的活性,表现出良好的抗氧化作用。而上述保护作用与14-3-3γ表达及PKCε活性有关。（2）葛根素通过14-3-3γ来发挥维持线粒体功能的作用,降低线粒体膜电位、减少线粒体通透性转换孔开放、降低氧消耗速率以及胞外酸化速率,起到保护线粒体的作用,以对抗阿霉素所带来的急性心肌毒性损伤。第五部分 葛根素预处理上调14-3-3γ/PKCε通路并激活适应性自噬保护小鼠心肌免受阿霉素急性毒性损伤目的:观察葛根素预处理通过14-3-3 γ/PKCε通路激活适应性自噬对阿霉素损伤小鼠心肌的保护作用方法:我们使用向心肌多点注射pAD/14-3-3γ-shRNA的方式构建小鼠在体心脏腺病毒载体模型,检测乳酸脱氢酶和肌酸同工酶MB活性,之后再进行ATP、GSH、GSSG含量检测,以确认葛根素预处理表现出阿霉素损伤小鼠心肌保护心肌,提升心肌功能及抗氧化的作用。接下来,我们使用HE染色法和TUNEL观察葛根素预处理对阿霉素损伤小鼠心肌改变的影响。除此之外,我们用小动物超声仪对小鼠心脏进行超声心动图检查,以取得更加直观的结果。最后,我们用免疫荧光印迹法检测通路中主要蛋白以及自噬重要标志蛋白的表达,以验证葛根素预处理产生的阿霉素损伤小鼠心肌保护作用是否与调节14-3-3γ/PKCε通路并激活适应性自噬有关。结果:葛根素预处理能够降低阿霉素损伤小鼠心肌乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶MB活性,但在pAD/14-3-3γ-shRNA小鼠则不能出现这种现象。对小鼠心肌的ATP、GSH、GSSG含量的检测也出现同样的结果。对小鼠心肌进行HE染色TUNEL检测,发现阿霉素损伤后,小鼠心肌组织出现炎性浸润、细胞肿胀和间质细胞肥大,以及许多明显的棕色TUNEL阳性心肌细胞。同时,心肌细胞裂解产物caspase-3活性显著升高,使用葛根素预处理能有效降低caspase-3活性,改变小鼠紊乱的心肌结构;当加入pAD/14-3-3γ-shRNA,葛根素以上改善及保护作用被取消。超声心动图检查显示,阿霉素损伤组乳左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）增大,左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）减小;使用葛根素预处理后,小鼠异常的心功能得到改善。同样,这些心功能的改善也可因pAD/14-3-3γ-shRNA的给予而被取消。免疫荧光印迹法检测显示,经阿霉素处理的小鼠心肌组织中14-3-3γ和PKCε未见明显变化,但p-PKCε的表达明显减弱,线粒体中的p-PKCε的表达也出现同样变化;自噬标志物LC3Ⅱ表达明显减弱而P62表达显著增加。给予葛根素预处理可显著增加经受阿霉素损伤的小鼠心肌组织中14-3-3γ、PKCε和p-PKCε的表达,同时非常明显增加线粒体中p-PKCε（p-mitoPKCε）的表达;自噬标志物LC3Ⅱ表达明显增强而P62表达明显减弱,但注射pAD/14-3-3γ-shRNA的小鼠心肌组织中14-3-3γ、PKCε和p-PKCε的表达均出现不同程度的减少,线粒体中p-PKCε的表达也明显受到抑制;自噬标志物LC3Ⅱ表达明显减弱而P62表达显著增加。结论:葛根素预处理可改善阿霉素损伤小鼠的心肌功能,具有非常好的保护作用。这一作用的实验是通过上调14-3-3γ/PKCε通路、激活适应性自噬而实现的。第六部分 葛根素预处理对脂多糖诱导的急性心肌毒性损伤的保护作用目的:研究葛根素对脂多糖诱导原代心肌细胞急性心肌毒性保护作用的机制。方法:用原代心肌细胞建立脂多糖心肌损伤模型,用葛根素预处理,用本研究涉及相关因素单独或组合处理,在此基础上检测相关炎症因子、细胞存活率、乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、丙二醛、ROS、线粒体膜电位、线粒体通透性转换孔开放、caspase-3活性、细胞凋亡等,对葛根素对脂多糖所致急性心肌毒性损伤保护作用的机制进行探索。结果:葛根素浓度为80μM及160μM组与初始浓度（20μM）相比,细胞存活率明显升高（p＜0.05）,LDH活性显著降低（p＜0.05）,存在明显差异。而葛根素单独作用、pAD/14-3-3γ-shRNA、3-MA单独作用下的细胞的存活率、LDH活性与对照组相比,无显著差异（p＞0.05）。同时,我们分别采用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ的表达,用自噬特异性抑制剂3-MA抑制自噬的产生,经葛根素预处理后,发现葛根素产生的保护作用被取消。我们分别采用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ的表达,用自噬特异性抑制剂3-MA抑制自噬的产生,经或不经葛根素预处理后,发现葛根素能够有效的抑制脂多糖对原代心肌细胞损伤所造成的细胞凋亡,减少ROS和MDA的产生,明显提高SOD、GSH-Px、CAT的活性,稳定线粒体膜电位,减少线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放当加入pAD/14-3-3γ-shRNA或者自噬特异性抑制剂3-MA,上述所有保护作用几乎完全被取消。结论:葛根素预处理可产生对脂多糖诱导的心肌损伤的保护作用,这种作用可能是葛根素上调14-3-3γ表达以及激活适应性自噬产生而引起的。第七部分 葛根素通过上调14-3-3γ表达和促进PKCε向线粒体迁移激活适应性自噬保护心肌细胞免受脂多糖的急性毒性损伤目的:观察葛根素是否通过14-3-3γ表达、PKCε表达与迁移以及两者相互作用来激活适应性自噬而保护心肌。方法:用免疫印迹法检测细胞中的14-3-3γ、PKCε和p-PKCε、线粒体p-PKCε、自噬相关标志物包括LC3-Ⅰ、LC3Ⅱ及P62等的表达,用免疫共沉淀实验确认14-3-3γ、PKCε之间是否存在相互作用。结果:经葛根素预处理的原代心肌细胞在经脂多糖损伤后,细胞中的14-3-3γ、PKCε和p-PKCε的表达均明显上升,线粒体中的p-PKCε的表达明显增加。当加入pAD/14-3-3γ-shRNA时,PKCε和p-PKCε均降低,线粒体中p-PKCε的表达也减少。经脂多糖损伤的细胞自噬被明显抑制,不能被激活,表现为自噬标志物LC3-Ⅱ升高不显著而P62明显升高,细胞内溶酶体虽略有增加,但增加不明显,这些都是自噬被抑制的表现。当使用葛根素进行预处理后,自噬被激活,表现为与脂多糖组比较,自噬标志物LC3-Ⅱ显著升高而P62显著降低;这一表现在加入3-MA抑制了适应性自噬而被取消。在14-3-3γ的免疫沉淀物中,对照组只检测到很低水平的PKCε,在脂多糖组PKCε水平略有增加,而在葛根素预处理组中PKCε水平显著增加。结论:葛根素预处理可以上调14-3-3γ、PKCε的表达,促进两者相互作用,并促进后者向线粒体转移,同时激活适应性自噬,达到保护心肌细胞、使其免受脂多糖损伤的作用。第八部分 葛根素预处理调节14-3-3y/PKCε通路及激活适应性自噬的激活保护小鼠心肌免受脂多糖的急性毒性损伤目的:验证葛根素预处理是否通过14-3-3γ/PKCε通路激活适应性自噬对脂多糖损伤小鼠心肌的保护作用方法:使用向心肌多点注射pAD/14-3-3γ-shRNA的方式构建小鼠在体心脏腺病毒载体模型,通过检测相关生化指标验证葛根素预处理在14-3-3γ存在下对脂多糖损伤小鼠心肌的保护作用。用免疫印迹法检测各组14-3-3γ、PKCε、p-PKCε、p-mitoPKCε以及自噬相关蛋白的表达。结果:葛根素预处理能够减少脂多糖损伤小鼠的心功能受损,pAD/14-3-3γ-shRNA能够取消葛根素预处理的这些作用。葛根素预处理的脂多糖损伤小鼠心肌组织中的PKCε磷酸化及向线粒体迁移受到抑制,同时适应性自噬也明显受到抑制。结论:葛根素预处理可改善脂多糖损伤小鼠的心肌功能,具有非常好的保护作用。这一作用是通过上调14-3-3γ/PKCε通路、激活适应性自噬而实现的。