酿酒酵母镉反应机理及镉拮抗物筛选初步研究

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重金属镉(Cd)是已知的在生物体内最易蓄积的毒物之一,由于镉的生物半衰期长达10-40年,并且排出缓慢,极微量的镉持续不断进入体内就可因长期生物蓄积和生物放大作用,导致肺、肾脏、肝脏、胰腺、甲状腺、心脏和骨骼等多器官组织以及神经、生殖和免疫等系统的损伤。每年,我国重金属镉排放量多达680余吨,被镉污染的土地、农作物不断增加,严重危害居民的食品安全与身体健康。本论文以酿酒酵母为模型,采用平板计数和流式细胞技术检测四种不同浓度镉对酿酒酵母生长繁殖与代谢影响;用表达谱测序方法,检测了镉浓度320μM时,酿酒酵母基因组表达情况;采用平板计数初步筛选获得三种镉拮抗剂。1.平板计数法检测酿酒酵母镉处理后生长情况,结果表明,随着镉浓度的升高,酿酒酵母生长受到明显影响,当镉浓度达到320μM时,酿酒酵母生长完全受到抑制;精密酸度计测量培养液pH,随着金属浓度升高而升高;流式细胞仪(FCM)检测镉处理后细胞氧自由基(ROS)和线粒体膜电位(△Ψm)结果显示,随着镉浓度的升高,细胞内ROS浓度随之升高,△Ψm降低。酶标法检测谷胱甘肽(GSH)浓度,随着镉浓度升高,GSH含量升高。2.分析表达谱测序结果,共有912个DEG,其中415个DEG上调(最高上调8.25倍),497个DEG下调(最高下调5.37倍);将DEG根据KEGG数据库进行注释归类,共79条代谢途径发生改变,其中对核糖体代谢、硫代谢、氧化压力代谢相关、维生素代谢相关及有氧呼吸相关等途径影响最大;根据GO数据库注释归类,分别为生物途径(394条途径)、细胞成分(128条途径)、分子功能(725条途径)三类;根据COG数据库注释归类,分别为蛋白质翻译、核糖体结构和生物合成相关基因(156个DEG),预测功能相关基因(107个DEG),氨基酸转运和代谢(76个DEG)等25个类别中。3.以酿酒酵母作为筛选模型,研究了锌、铁、硒、镁对镉的拮抗作用结果显示,当镉浓度为40μM和160μM时,添加镉拮抗剂锌、铁、硒对拮抗镉均有显著作用;当镉浓度为40μM时,锌、硒、铁作用最佳浓度分别为120μM、15μM、5μM;当镉浓度为160μM时,为320μM,120μM,30μM;当镉浓度为80μM和320gM时,锌、铁和硒的加入对镉的毒性作用拮抗不显著;镁的加入对镉的毒性作用无拮抗效果。通过表达谱分析,研究基因水平镉作用机制,为镉毒性疾病治疗基因靶点的选取提供参考;筛选获得镉拮抗剂,为临床镉毒性疾病治疗药物的选取提供参考。
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