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背景与目的近年来,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗神经系统疾病被寄予厚望,但患者脑结构功能的病理改变可能直接影响干细胞移植物的存活和神经分化。Micro RNA(mi RNAs)是一类内源性的长约20~25个核苷酸的非编码RNA,参与调控骨髓间充质干细胞的增殖、分化、信号转导、死亡等重要生物学进程。Let-7g作为mi RNAs分子中的一员,可调控许多靶基因参与细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭及迁移等生命过程,目前尚未见Let-7g对骨髓间充质干细胞生物学活性的研究。本文通过构建Let-7g上调及下调慢病毒载体并体外转染骨髓间充质干细胞,实现Let-7g在细胞中过表达及低表达,探讨Let-7g对骨髓间充质干细胞增殖、迁移及神经分化的影响及其可能作用机制,以寻找提高干细胞移植物质量的方法,为骨髓间充质干细胞颅内移植治疗提供新的思路。材料与方法1选取6-8周龄,体重为100-120g的SPF级SD大鼠2只,采用全骨髓培养法分离培养骨髓间充质干细胞,并连续传代培养6代以上备用。2构建大鼠Let-7g上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,筛选最适转染复数;根据转染慢病毒载体的情况可分为4个不同的实验组:未转染组(未进行病毒转染)、阴性转染组(转染空白慢病毒+EGFP)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7g-up+EGFP)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7g-5p-inhibition+EGFP);采用RT-PCR方法检测转染后各组细胞Let-7g表达水平。3采用Western blot法和免疫细胞化学法检测各组高迁移率族蛋白2(high mobility group-AT-hook 2,HMGA2)的表达水平;采用MTT法检测各组细胞的增殖能力;采用Transwell迁移实验及划痕实验检测各组细胞的迁移能力;了解不同Let-7g表达水平对HMGA2的表达以及对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响。4采用法舒地尔体外诱导各组骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。5采用免疫细胞化学法和Western blot法检测分化后各组细胞的神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经微管结合蛋白(microtubule associated protein 2,MAP-2)和Notch-1的表达变化;RT-PCR检测MAP-2 m RNA和Notch-1m RNA的表达变化。了解Let-7g在体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用及其与Notch信号通路的关系。6使用分析软件预测Let-7g的潜在靶基因;行双荧光素酶报告基因实验检测Let-7g对Notch-1的靶向调节作用。7侧脑室移植PKH26标记的骨髓间充质干细胞,2周后倒置荧光显微镜下观察其在SD大鼠脑内的存活分布情况。结果1倒置荧光显微镜下观察慢病毒载体可高效转染MSCs,各转染组EGFP的表达无显著性差异。RT-PCR法检测发现未转染组Let-7g的表达水平与阴性转染组的比较无显著性差异(P>0.05);转染上调组Let-7g的表达水平显著高于未转染组和阴性转染组(P<0.05);转染下调组Let-7g的表达水平显著低于未转染组和阴性转染(P<0.05)。2与阴性转染组相比,转染上调组细胞增殖能力及迁移能力减弱,HMGA2表达率明显减低(P<0.05),而转染下调组细胞增殖能力及迁移能力增强,HMGA2表达率明显增高(P<0.05)。3法舒地尔可以诱导MSCs分化为神经细胞;与阴性转染组相比,转染上调组的诱导效率增高,NSE、MAP-2及MAP-2 m RNA的表达增高(P<0.05),Notch-1及Notch-1 m RNA的表达减低(P<0.05),而转染下调组的诱导效率减低,NSE和MAP-2及MAP-2 m RNA的表达减低(P<0.05),Notch-1及Notch-1 m RNA的表达增高(P<0.05)。4在Target Scan,mi RBase数据库均预测Notch-1为Let-7g的靶基因;转染Notch-1 3’UTR+rno-let-7g-5p重组质粒荧光素强度水平明显低于其对照组(P<0.05)。5脑组织中可观察到PKH26标记阳性的细胞,分布在侧脑室,部分迁移。结论1 Let-7g可能通过HMGA2抑制MSCs增殖、迁移能力。2 Let-7g可促进MSCs向神经细胞分化;Notch-1是Let-7g的靶基因之一;提示Let-7g可能通过Notch信号通路促进MSCs诱导分化为神经细胞。3经侧脑室移植入SD大鼠脑内的MSCs存活良好,少数可迁移。