血栓性疾病严重威胁着人类的健康,血栓形成的机制和防治的研究是医学科学领域重大课题之一。研究发现,FVIII水平升高已经成为动静脉血栓形成的一个独立危险因素,高水平的FVIII主要通过凝血途径增加凝血酶和纤维蛋白形成率以及刺激凝血酶生成进一步引起血小板激活和纤维蛋白的形成等机制参与动静脉血栓的形成。而且,研究发现FVIII水平降低对于缺血性心脏病有保护作用。在血友病A患者中由于缺血性心脏病死亡的人数明显低于正常男性人群,这提示FVIII参与了动脉血栓的发病机制。另一方面,对血友病A的患者观察发现发生静脉血栓的情况很少。这些结果均提示通过抑制FVIII活性来进行抗栓治疗是可能的。作为一种具有靶向性的生物大分子,单克隆抗体始终是人们关注的热点之一,被广泛用于治疗肿瘤、病毒感染以及抗移植排斥等多种疾病。临床应用取得了较好效果,显示了单克隆抗体药物治疗疾病的良好前景。其所具有的特异性以及药代动力学特征亦为预防和治疗血栓性疾病提供了新的方向。FVIII-C2区含有与vWF、PS、FXa以及凝血酶等蛋白结合的位点,具有重要的病理生理功能。因此,本研究制备了针对FVIII-C2区的单克隆抗体并对其功能及机制进行了研究。试验分三部分:(1)在大肠杆菌中表达了FVIII-C2区蛋白并研究了其功能;(2)用rFVIII-C2区蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,经标准单克隆抗体技术制备并鉴定了一株FVIII-C2区单克隆抗体SZ-132;(3)研究了SZ-132抑制FVIII促凝活性,并通过研究SZ-132抑制rhFVIII-vWF、rhFVIII-PS结合试验以及SZ-132抑制rhFVIII与血小板的结合来阐明SZ-132抑制FVIII促凝活性的可能机制。第一部分人FVIII-C2区在大肠杆菌中的表达及功能研究FVIII是内源性凝血途径中一个重要的辅因子,其包涵2332个氨基酸。由A1-A2-A3-B-C1-C2结构域组成,其中C2区含有与血管性血友病因子(vWF)、磷脂(PL)等结合的位点。在血浆中,FVIII通过非共价键与vWF结合避免其被降解,与血小板上磷脂膜的结合对于发挥FVIII的促凝作用至关重要。因此,FVIII-C2区对于维持FVIII的稳定性以及活性具有重要的意义。本研究中采用PCR技术从含有hFVIII-cDNA的质粒中扩增出FVIII-C2区基因,经电泳及测序正确后,将其连接至原核表达载体pQE30中,构建出pQE30-FVIII-C2表达质粒,经ITPG诱导表达后,收集细菌反复冻融,超声破菌,SDS-PAGE电泳观察表达蛋白的存在形式,用western blot方法鉴定表达的蛋白,应用金属螯合层析法纯化目的蛋白。ELISA法测定重组的FVIII-C2区蛋白与血管性血友病因子(vWF)和磷脂酰丝氨酸(PS)的结合。结果显示,PCR反应扩增出489 bp的特异性片段,测序结果与已知的FVIII-C2区cDNA序列完全一致。重组的pQE30-FVIII-C2质粒转染大肠杆菌M15,经ITPG诱导4-6 h后可高效表达目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的48%左右,以包涵体形式存在。Western blot结果显示重组的蛋白能够特异地和His抗体起反应。ELISA法测定重组蛋白与vWF和PS结果表明,该重组蛋白呈剂量依赖方式与vWF和PS结合,说明在FVIIIC2区含有与vWF和PS的结合位点。第二部分抗FVIII-C2区特异性单克隆抗体SZ-132的研制和鉴定FVIII水平升高已经成为动静脉血栓形成的一个独立危险因素。而且,研究发现FVIII水平降低对于缺血性心脏病有保护作用。在血友病A患者中由于缺血性心脏病死亡的人数明显低于正常男性人群,这提示FVIII参与了动脉血栓的发病机制。另一方面,对血友病A的患者观察发现发生静脉血栓的情况很少。这些结果均提示通过抑制FVIII活性来进行抗栓治疗是可能的。单克隆抗体所具有的特异性以及药代动力学特征亦为预防和治疗血栓性疾病提供了新的方向。针对血液凝固途径中的凝血因子(如组织因子TF、FIX以及FVIII等)的单克隆抗体的研制已经成为研究的热点。鉴于FVIII-C2区所具有的重要病理生理功能,本研究应用重组的FVIII-C2区蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用经典的杂交瘤融合技术制备抗FVIII-C2区的单克隆抗体,结果获得了一株与FVIII-C2蛋白反应最强的单克隆抗体,命名为SZ-132。ELISA法及western blot结果显示SZ-132能够与rhFVIII及rFVIII-C2蛋白反应,提示SZ-132是针对FVIII-C2区的特异性单克隆抗体。第三部分抗FVIII-C2区单克隆抗体SZ-132的功能研究已有研究发现,针对FVIII的单克隆抗体能够抑制FVIII的促凝活性,在动物血栓模型实验中能够抑制血栓的形成。本研究在体外观察了SZ-132对FVIII促凝活性的作用。将不同浓度的SZ-132与健康成人的混合血浆孵育后,当SZ-132浓度为0～25μg/ml时,该抗体呈剂量依赖的方式抑制FVIII活性;SZ-132对正常人新鲜混合血浆FVIII活性的抑制率为0～(95.00±3.12)%;浓度大于25μg/ml时,FVIII活性完全被抑制。IC50为7.96μg/ml。APTT测定显示孵育后明显延长,当浓度为0～25μg/ ml时,APTT值为(33.4±9.8)s～(83.8±7.3)s。对照组SZ-123对FVIII活性及APTT均无影响(n=3)。为了研究SZ-132抑制FVIII活性的可能机制,本研究观察了SZ-132对rhFVIII-vWF及rhFVIII-PS的结合的影响,结果发现SZ-132可以抑制上述结合反应,在SZ-132对rhFVIII-vWF结合实验的影响中,当SZ-132浓度为0～100μg/ ml时,在490nm处测得的OD值为(3.28±0.45)～(0.24±0.12);而SZ-132对rhFVIII-PS结合实验的影响中,测得的OD值为(3.25±0.50)～(0.41±0.14)。对照组SZ-123对上述结合实验无影响。(n=3)。IC50分别为10.71μg/ml和9.88μg/ml。该实验解释了SZ-132抑制FVIII活性的机制,同时表明FVIII在vWF和PS上的结合位点相邻或有重叠。本研究观察了SZ-132对rhFVIII与血小板结合实验的影响,结果发现SZ-132能够以剂量依赖的方式抑制二者的结合。当SZ-132浓度为0～100μg/ml时,在490nm处测得的OD值为(2.65±0.25)～(0.56±0.10)。对照组SZ-123对二者结合无影响。(n=3)。上述结果表明,SZ-132是一株针对FVIII-C2区的抑制性单克隆抗体,其可能通过抑制rhFVIII-vWF和rhFVIII-PS的结合抑制FVIII的促凝活性。