H9亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播,并已在家禽中进化出多种基因型。在我国,根据国家流感中心对2014年至2019年禽流感病毒的监测分析:H9N2已经取代H5N6和H7N9成为我国鸡鸭群中的优势禽流感病毒亚型。H9N2亚型禽流感造成家禽免疫力下降,引发其它病原菌的继发感染,导致生产性能下降和死亡率上升,严重威胁家禽养殖业的健康发展。此外,近年来H9N2亚型禽流感病毒感染人的事件时有发生,给公共卫生造成潜在的威胁。疫苗免疫和相关生物安全措施仍是防治该病的主要手段,监测抗体水平是评估疫苗免疫效果和预防发病最有效的方法,而AIV H9单克隆抗体是研究病毒致病机制和建立病毒检测方法基础的物质材料,因此单克隆抗体制备和H9亚型禽流感抗体检测试纸的研究具有重要意义。本研究以重组H9N2 HA蛋白水稻种子为材料,初步建立重组HA蛋白的纯化工艺。在此基础上,重组H9N2 HA蛋白作为免疫原,免疫6-8周龄Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体;其次,以胶体金标记重组H9N2 HA蛋白为探针,兔抗鸡IgG和纯化的H9N2亚型多抗血清分别作为检测线和质控线,结合禽流感HI检测方法,建立AIV H9抗体检测试纸。1.水稻表达重组H9N2 HA蛋白的纯化重组H9N2 HA蛋白水稻种子与提取液按照质量体积(g·L-1)比1:5粗蛋白提取1.5 h,经离心和过滤,得到HA蛋白粗提液。经过阴离子柱筛选、疏水柱筛选和阳离子柱筛选后,按照不同次序将三者组合进行筛选,最终三步层析法得到高纯度的HA蛋白。Q阴离子柱27%洗脱,目的蛋白得到富集和浓缩;Butyl疏水柱100%洗脱,除去大多杂蛋白;S阳离子柱12%洗脱,精细纯化得到高纯度HA蛋白。SDS-PAGE和Western-blot表明:经过三步层析HA蛋白纯度在85%以上。2.AIV H9单克隆抗体的制备纯化的重组H9N2 HA蛋白与ISA 50V佐剂按照体积比1:1混和乳化,皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠,每只免疫10μg。两周接种一次,建立间接ELISA方法测定小鼠血清效价,三免一周后,效价最高的小鼠腹腔注射重组HA蛋白。融合后,间接ELISA方法结合HI法筛选阳性细胞株,多次亚克隆后得到6株能稳定分泌抗体的单克隆细胞株。其中5A5抗体亚类为IgG2a,3A5、4E8、8G8、11E3、12E5抗体亚类均为IgG1,6株抗体轻链均为Kappa;特异性实验表明6株腹水与H5、NDV和空载水稻蛋白都不反应;细胞中和实验表明3A5、4E8、8G8具有中和活性;6株单抗均具有血凝抑制作用;IPMA表明所有抗体对H9N2病毒均呈特异性显色反应。3.AIV H9抗体检测试纸的研制利用胶体金标记纯化H9 HA蛋白为探针,兔抗鸡IgG和AIV H9多抗血清分别作为检测线和质控线,依据禽流感HI诊断技术标准（HI≥4log2抗体为阳性）,建立一种AIV H9抗体检测试纸。对试纸各组分进行改良试验可得:试纸胶体金标记HA最佳蛋白量为30mg·L-1;兔抗鸡IgG和HA多抗最佳包被浓度分别为1 g·L-1和1.2 g·L-1。对该试纸的特异性、灵敏性、稳定性和HI比对进行测试,结果表明:试纸与H5 AIV、新城疫病毒（NDV）、马立克氏病病毒（MDV）、新城疫病毒（NDV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）阳性血清以及H9阴性血清无交叉反应;试纸检测H9N2亚型阳性血清（HI为11log2）的最低检出限是1:12 800,这与HI效价为4log2相当;试纸在室温下至少能保存6个月;试纸与HI试验的总符合率为90.6%。本试验成功研制了一种简单、快速、特异的免疫层析试纸,可初步应用于AIV H9亚型抗体的临床检测。