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原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其中90%以上是肝细胞癌(以下简称肝癌)，现已成为全球癌症相关死亡的第四大原因，也是中国癌症死亡的第三大原因。由于肝癌早期发现较困难，中晚期治疗效果有限，亟需研究新的治疗方法和治疗策略。中医药经过数千年的发展，是一种兼具整体观和辨证论治思维的医学体系，目前有研究指出，中国大多数的癌症患者都接受了中医药治疗1。解毒颗粒是由猫人参、山慈菇、石见穿、鸡内金组成的中药复方，在临床上用于肝癌的治疗取得了良好的疗效，但是目前解毒颗粒的物质基础和抗肝癌作用机制仍不明确。
本研究旨在基于液质联用技术，初步阐明解毒颗粒的药效物质基础，通过网络药理学、人基因表达谱芯片、生物信息学、细胞实验和动物实验分析解毒颗粒治疗肝癌的分子机制，为临床应用和二次开发提供依据。
本研究主要分为两个部分
第一部分：解毒颗粒的药效物质基础研究
基于液质联用技术的解毒颗粒全成分定性研究：采用液质联用(UHPLC-LTQ-Orbitrap)技术，对解毒颗粒所含化学成分进行了研究。通过查阅原始文献和数据库，建立解毒颗粒化学成分数据库，通过提取离子流图和二级质谱图快速鉴定解毒颗粒的化合物成分。液相条件为：色谱柱采用AcquityUPLCHSST3(1.8μm×2.1mm)，流动相由4mmol/L乙酸铵0.08%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)组成,其洗脱梯度为：0–8min：5–40%B，8–16min：40–50%B，16–24min：50–95%B，24–26min：95%B，26.01–30min：85.01–90%B。流速为0.1mL/min。质谱条件为：通过电喷雾离子源与液相部分连接，采用正负离子全扫模式，扫描范围为m/z50–1500，离子源所用气体为氮气。结果显示，对解毒颗粒的主要化学成分进行分析，共鉴定64种化合物，包括9个苯丙素类成分、14个三萜类成分、7个酚酸类成分、7个黄酮类成分等。
基于液质联用技术的解毒颗粒血清移行成分定性研究：采用UHPLC-LTQ-Orbitrap联用技术，对小鼠服用解毒颗粒后的血清移行成分进行了研究。液相条件为：色谱柱采用PlatisilODSC18柱(5μm×4.6mm)，流动相由4mmol/L乙酸铵0.08%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)组成,其洗脱梯度为：0–20min：5–40%B；20–40min：40–50%B；40–80min：50–95%B；80–85min：95%B；40–80min：85.01–90%B。流速为0.1mL/min。质谱条件为：通过电喷雾离子源与液相部分连接，采用正负离子全扫模式，扫描范围为m/z50–1500，离子源所用气体为氮气。对解毒颗粒的血清移行成分进行分析，在血清样本中鉴定出咖啡酸、丹参素、积雪草酸等17种化合物。
基于网络药理学的解毒颗粒治疗肝癌机制初步研究：基于以上研究，通过网络药理学的方法，结合人基因表达谱芯片结果，以解毒颗粒的31个代表性化合物在PubChem数据库筛选得到1720个靶点，在OncoDB.HCC和Liverome数据库筛选得到与肝癌相关的靶标566个，二者映射得到62个解毒颗粒作用在肝癌的潜在靶点。通过Cytoscape软件得出药物-成分-靶标网络图，通过String数据库构建蛋白相互作用网络，通过GO和KEGG通路富集分析得出解毒颗粒治疗肝癌相关的关键性功能和通路，为后续细胞实验提供基础。
第二部分：解毒颗粒药效成分治疗肝癌的分子机制研究
SLC39A10(ZIP10)基因在肝癌中的生物学功能研究：通过人基因表达谱芯片和网络药理学发现，SLC39A10基因在解毒颗粒治疗肝癌中发挥重要作用。通过TCGA、HCCDB、GEPIA、HPA数据库的分析，发现SLC39A10在肝癌组织中的表达明显高于在正常组织，在晚期肝癌的表达明显高于早期肝癌，SLC39A10低表达患者的生存率高于SLC39A10高表达患者，SLC39A10的过表达与HCC患者的不良预后相关。多因素分析证实了SLC39A10表达水平对肝癌预后的预测意义。WesternBlot实验表明，HCCLM3细胞的SLC39A10相对表达量较高，MHCC97-L细胞的SLC39A10相对表达量较低，因此，在HCCLM3细胞中干扰SLC39A10的表达，在MHCC97-L细胞中过表达SLC39A10，通过细胞形态变化，划痕实验，Transwell小室迁移和侵袭实验，体外小管形成实验发现，HCCLM3细胞干扰SLC39A10后的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显下降，而MHCC97-L过表达SLC39A10后的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显提高。WesternBlot实验表明，转染过表达SLC39A10的质粒，能下调E-cadherin的表达同时促进N-cadherin及Vimentin的表达，相反，当SLC39A10被干扰时，则E-cadherin表达上升而N-cadherin及Vimentin的表达下降。SLC39A10可能通过促进STAT3的磷酸化而促进肝癌细胞转移，也可能通过促进PI3K的磷酸化而促进肝癌细胞转移。体内实验表明，SLC39A10基因过表达可以促进EMT相关蛋白的表达，并且促进肿瘤的生长和转移。
解毒颗粒活性成分通过抑制SLC39A10(ZIP10)来抑制肝癌细胞的侵袭和转移：选择解毒颗粒的活性成分原儿茶酸和羟基积雪草酸进行干预，通过细胞形态变化，划痕实验，Transwell小室迁移和侵袭实验，体外小管形成实验发现，过表达SLC39A10细胞的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显下降，WesternBlot实验表明，加入原儿茶酸或者羟基积雪草酸，均可以抑制过表达SLC39A10后E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2、Snail、Wnt2等蛋白的表达。另一方面，原儿茶酸和羟基积雪草酸均可以抑制JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路，进而抑制EMT作用。体内实验表明，原儿茶酸和羟基积雪草酸在裸鼠体内对肝癌生长存在抑制作用。
解毒颗粒对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的研究：通过建立小鼠H22皮下移植瘤模型，并以索拉非尼为对照，研究解毒颗粒针对H22皮下移植瘤的抑制作用及对小鼠生存期的影响。解毒颗粒低剂量组和高剂量组抑瘤效果较好，并在第21天的生存率较高。解毒颗粒高剂量组和索拉非尼组均出现了肿瘤坏死程度上升，肿瘤细胞密度下降，肿瘤细胞异型性下降，核分裂像计数下降的现象(P＜0.01)，且在肿瘤细胞密度评分和肿瘤细胞异型性方面，解毒颗粒高剂量组效果优于低剂量组(P＜0.05)。
因此，我们可以得到以下结论：
1.本文深入研究了解毒颗粒的全成分和血清移行成分组成，解毒颗粒的主要成分包括9个苯丙素类成分、14个三萜类成分、7个酚酸类成分、7个黄酮类成分等64种成分，而解毒颗粒的血清移行成分包括咖啡酸、丹参素、积雪草酸等17种成分。并且，基于网络药理学探讨了解毒颗粒治疗肝癌的主要作用机制和活性成分。
2.SLC39A10通过激活JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路促进肝癌的侵袭和迁移，而这一作用能被解毒颗粒的活性成分羟基积雪草酸和原儿茶酸所抑制。
本研究旨在基于液质联用技术，初步阐明解毒颗粒的药效物质基础，通过网络药理学、人基因表达谱芯片、生物信息学、细胞实验和动物实验分析解毒颗粒治疗肝癌的分子机制，为临床应用和二次开发提供依据。
本研究主要分为两个部分
第一部分：解毒颗粒的药效物质基础研究
基于液质联用技术的解毒颗粒全成分定性研究：采用液质联用(UHPLC-LTQ-Orbitrap)技术，对解毒颗粒所含化学成分进行了研究。通过查阅原始文献和数据库，建立解毒颗粒化学成分数据库，通过提取离子流图和二级质谱图快速鉴定解毒颗粒的化合物成分。液相条件为：色谱柱采用AcquityUPLCHSST3(1.8μm×2.1mm)，流动相由4mmol/L乙酸铵0.08%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)组成,其洗脱梯度为：0–8min：5–40%B，8–16min：40–50%B，16–24min：50–95%B，24–26min：95%B，26.01–30min：85.01–90%B。流速为0.1mL/min。质谱条件为：通过电喷雾离子源与液相部分连接，采用正负离子全扫模式，扫描范围为m/z50–1500，离子源所用气体为氮气。结果显示，对解毒颗粒的主要化学成分进行分析，共鉴定64种化合物，包括9个苯丙素类成分、14个三萜类成分、7个酚酸类成分、7个黄酮类成分等。
基于液质联用技术的解毒颗粒血清移行成分定性研究：采用UHPLC-LTQ-Orbitrap联用技术，对小鼠服用解毒颗粒后的血清移行成分进行了研究。液相条件为：色谱柱采用PlatisilODSC18柱(5μm×4.6mm)，流动相由4mmol/L乙酸铵0.08%甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)组成,其洗脱梯度为：0–20min：5–40%B；20–40min：40–50%B；40–80min：50–95%B；80–85min：95%B；40–80min：85.01–90%B。流速为0.1mL/min。质谱条件为：通过电喷雾离子源与液相部分连接，采用正负离子全扫模式，扫描范围为m/z50–1500，离子源所用气体为氮气。对解毒颗粒的血清移行成分进行分析，在血清样本中鉴定出咖啡酸、丹参素、积雪草酸等17种化合物。
基于网络药理学的解毒颗粒治疗肝癌机制初步研究：基于以上研究，通过网络药理学的方法，结合人基因表达谱芯片结果，以解毒颗粒的31个代表性化合物在PubChem数据库筛选得到1720个靶点，在OncoDB.HCC和Liverome数据库筛选得到与肝癌相关的靶标566个，二者映射得到62个解毒颗粒作用在肝癌的潜在靶点。通过Cytoscape软件得出药物-成分-靶标网络图，通过String数据库构建蛋白相互作用网络，通过GO和KEGG通路富集分析得出解毒颗粒治疗肝癌相关的关键性功能和通路，为后续细胞实验提供基础。
第二部分：解毒颗粒药效成分治疗肝癌的分子机制研究
SLC39A10(ZIP10)基因在肝癌中的生物学功能研究：通过人基因表达谱芯片和网络药理学发现，SLC39A10基因在解毒颗粒治疗肝癌中发挥重要作用。通过TCGA、HCCDB、GEPIA、HPA数据库的分析，发现SLC39A10在肝癌组织中的表达明显高于在正常组织，在晚期肝癌的表达明显高于早期肝癌，SLC39A10低表达患者的生存率高于SLC39A10高表达患者，SLC39A10的过表达与HCC患者的不良预后相关。多因素分析证实了SLC39A10表达水平对肝癌预后的预测意义。WesternBlot实验表明，HCCLM3细胞的SLC39A10相对表达量较高，MHCC97-L细胞的SLC39A10相对表达量较低，因此，在HCCLM3细胞中干扰SLC39A10的表达，在MHCC97-L细胞中过表达SLC39A10，通过细胞形态变化，划痕实验，Transwell小室迁移和侵袭实验，体外小管形成实验发现，HCCLM3细胞干扰SLC39A10后的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显下降，而MHCC97-L过表达SLC39A10后的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显提高。WesternBlot实验表明，转染过表达SLC39A10的质粒，能下调E-cadherin的表达同时促进N-cadherin及Vimentin的表达，相反，当SLC39A10被干扰时，则E-cadherin表达上升而N-cadherin及Vimentin的表达下降。SLC39A10可能通过促进STAT3的磷酸化而促进肝癌细胞转移，也可能通过促进PI3K的磷酸化而促进肝癌细胞转移。体内实验表明，SLC39A10基因过表达可以促进EMT相关蛋白的表达，并且促进肿瘤的生长和转移。
解毒颗粒活性成分通过抑制SLC39A10(ZIP10)来抑制肝癌细胞的侵袭和转移：选择解毒颗粒的活性成分原儿茶酸和羟基积雪草酸进行干预，通过细胞形态变化，划痕实验，Transwell小室迁移和侵袭实验，体外小管形成实验发现，过表达SLC39A10细胞的侵袭和迁移能力，血管形成能力明显下降，WesternBlot实验表明，加入原儿茶酸或者羟基积雪草酸，均可以抑制过表达SLC39A10后E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2、Snail、Wnt2等蛋白的表达。另一方面，原儿茶酸和羟基积雪草酸均可以抑制JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路，进而抑制EMT作用。体内实验表明，原儿茶酸和羟基积雪草酸在裸鼠体内对肝癌生长存在抑制作用。
解毒颗粒对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的研究：通过建立小鼠H22皮下移植瘤模型，并以索拉非尼为对照，研究解毒颗粒针对H22皮下移植瘤的抑制作用及对小鼠生存期的影响。解毒颗粒低剂量组和高剂量组抑瘤效果较好，并在第21天的生存率较高。解毒颗粒高剂量组和索拉非尼组均出现了肿瘤坏死程度上升，肿瘤细胞密度下降，肿瘤细胞异型性下降，核分裂像计数下降的现象(P＜0.01)，且在肿瘤细胞密度评分和肿瘤细胞异型性方面，解毒颗粒高剂量组效果优于低剂量组(P＜0.05)。
因此，我们可以得到以下结论：
1.本文深入研究了解毒颗粒的全成分和血清移行成分组成，解毒颗粒的主要成分包括9个苯丙素类成分、14个三萜类成分、7个酚酸类成分、7个黄酮类成分等64种成分，而解毒颗粒的血清移行成分包括咖啡酸、丹参素、积雪草酸等17种成分。并且，基于网络药理学探讨了解毒颗粒治疗肝癌的主要作用机制和活性成分。
2.SLC39A10通过激活JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路促进肝癌的侵袭和迁移，而这一作用能被解毒颗粒的活性成分羟基积雪草酸和原儿茶酸所抑制。