【摘 要】
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目的:探讨线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2介导的线粒体动态变化与卵巢癌细胞顺铂耐药机制之间的关系。方法:本实验选择了人卵巢癌顺铂非耐药细胞株SKOV3和顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP。观察两种细胞线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2之间的表达差异。为了验证线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2在卵巢癌顺铂耐药机制中的作用,我们分别向两种卵巢癌细胞内转染si RNA,以敲低SKOV3
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目的:探讨线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2介导的线粒体动态变化与卵巢癌细胞顺铂耐药机制之间的关系。方法:本实验选择了人卵巢癌顺铂非耐药细胞株SKOV3和顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP。观察两种细胞线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2之间的表达差异。为了验证线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2在卵巢癌顺铂耐药机制中的作用,我们分别向两种卵巢癌细胞内转染si RNA,以敲低SKOV3细胞中Drp1蛋白和SKOV3/DDP细胞中Mfn2蛋白的表达。为了观察不同情况下卵巢癌细胞内线粒体的形态差异,将p Ds Red2-Mito质粒分别转染入不同处理的细胞中以标记线粒体,并用共聚焦显微镜观察不同条件下细胞内线粒体的形态。利用ATP检测试剂盒分别检测不同细胞和不同处理条件下细胞的ATP水平。采用划痕实验和Transwell实验观察细胞在不同条件下的迁移能力。用DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS,并通过流式细胞仪定量检测各组细胞中的活性氧水平。为了验证不同条件下细胞的凋亡水平,我们通过Western Blot检测不同组细胞中Bax的表达水平以及Caspase-3和Caspase-9的活化水平。结果:Western Blot实验结果表明,SKOV3细胞中线粒体分裂蛋白Drp1的表达水平显著高于SKOV3/DDP细胞,而融合蛋白Mfn2的表达水平则相反。通过共聚焦显微镜观察发现,SKOV3/DDP细胞内线粒体的平均长度比SKOV3细胞长;SKOV3细胞敲低Drp1后,线粒体分裂明显减少;SKOV3/DDP细胞敲低Mfn2后,线粒体分裂明显增多。通过检测细胞内的ATP水平发现:SKOV3细胞内的ATP水平高于SKOV3/DDP细胞;并且,敲低了Drp1蛋白的SKOV3细胞的ATP水平相较于SKOV3细胞有所下降,敲低了Mfn2蛋白的SKOV3/DDP细胞与SKOV3/DDP细胞相比,ATP水平明显上升。通过划痕实验和Transwell实验发现,SKOV3细胞比SKOV3/DDP细胞具有更强的迁移能力;SKOV3细胞敲低Drp1蛋白后,细胞的迁移能力弱于SKOV3细胞;SKOV3/DDP细胞敲低Mfn2蛋白后,与SKOV3/DDP细胞相比,细胞的迁移能力明显增强。进一步通过细胞内ROS水平的结果发现,SKOV3+Drp1 si RNA组与SKOV3细胞对照组之间ROS水平无明显差异,SKOV3+DDP组细胞内ROS水平最高,SKOV3+Drp1si RNA+DDP组ROS水平比SKOV3+DDP组明显降低。通过Western Blot结果发现,SKOV3+Drp1 si RNA组与SKOV3细胞对照组相比,Bax的表达水平、Caspase-3和Caspase-9的活化水平无明显差异;在SKOV3+DDP组中,Bax的表达水平和Caspase-3、Caspase-9的活化水平最高;SKOV3+Drp1 si RNA+DDP组细胞内凋亡蛋白Bax的表达水平和Caspase-3、Caspase-9的活化水平相较于SKOV3+DDP组明显降低。结论:线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2参与了卵巢癌细胞的ATP生成、细胞迁移、ROS产生和凋亡等过程;通过这些结果发现,线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2可能与卵巢癌细胞的顺铂耐药机制有关,从而为临床上治疗卵巢癌奠定新的基础。
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