钛银合金纳米管抗菌性和生物相容性的体内、外实验研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiachengpu
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目的:  为了同时满足抗菌性以及生物相容性的要求,本文制备了具有不同银含量的新型生物材料“钛银合金纳米管”,通过与纯钛以及钛纳米管进行对比,明确钛银合金纳米管的抗菌性以及生物相容性,并探究不同的银含量对其生物学性能的影响。  方法:  首先通过阳极氧化技术制备钛银合金纳米管,利用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线衍射分析(XRD)、能谱分析(EDS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)以及电化学实验(Electricalchemical Test),分别对钛银合金纳米管的表面形貌、表面粗糙度、内部晶型结构、内部元素含量及分布,银离子释放以及样品耐腐蚀能力进行分析。然后,在钛银合金纳米管表面种植金黄色葡萄球菌并培养24小时,之后利用SEM观察细菌的粘附率;再通过SYTO9/PI活、死细菌染色,在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察细菌活性。同时,将样品在PBS中浸泡30天,而后利用平板涂布实验和抑菌环实验观察钛银合金纳米管的长期抗菌性以及杀菌方式。在生物相容性评价实验中,于钛银合金纳米管表面种植人骨肉瘤细胞MG63,利用SEM观察24小时后的细胞粘附率以及细胞形态;通过Calcein-AM/PI活、死细胞染色,在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察共培养24小时后的细胞活性;将MG63细胞在各样品表面培养1、3、5天,利用CCK-8方法对细胞活性进行定量分析;将MG63细胞在各样品表面培养1、4、7天,利用(PI单染)流式细胞分析仪分析其细胞周期,计算相应的增值分数(PI proliferation index)并判断各样品表面细胞的增值情况;将MG63细胞在各样品表面培养3、5、7天,分析其ALP含量并比较各样品表面的细胞分化情况;将MG63细胞在各样品表面培养1、4、7天,利用(Annexin-Ⅴ/PI双染)流式细胞分析仪分析其凋亡情况,并比较各样品对于细胞凋亡的影响。在体内实验中,将各材料植入SD大鼠股骨内并观察1、2、4周,而后利用Micro-CT以及H&E染色法比较不同样品周围的骨总量,同时,利用免疫组化法检测样品周围骨组织中BMP-2蛋白的表达量,判断不同材料对周围组织成骨分化能力的影响。  结果:  (1)利用阳极氧化技术,在钛银合金表面成功制备出了表面结构均匀、与基底牢固相连、开口向外的丛林状的纳米管阵列,其直径为20nm。与光滑钛(cp-Ti)进行对比,可见钛纳米管(TNT)、1%钛银合金纳米管(Ti1%Ag-NT)、2%钛银合金纳米管(Ti2%Ag-NT)以及4%钛银合金纳米管(Ti4%Ag-NT)拥有更高的表面粗糙度。在光滑钛内部,只有Ti晶体;在钛纳米管内部,可见Ti以及TiO2两种晶体;而在钛银合金纳米管样品中,除了Ti和TiO2外,还可见到TiAg以及Ag2O晶体。在能谱分析中,钛银合金纳米管内实际的银含量分别是:1%钛银合金纳米管为0.9wt%,2%钛银合金纳米管为1.96wt%,4%钛银合金纳米管3.91wt%,钛、银、氧三种元素均匀的分布在钛银合金纳米管材料表面。在离子释放实验中,从钛银合金纳米管的浸提液中未能检测到游离的银离子;电化学实验证明钛银合金纳米管表面发生了明显的腐蚀反应,钛银合金纳米管的抗腐蚀能力弱于光滑钛。  (2)钛银合金纳米管的抗菌性(长、短期)显著优于纯钛以及钛纳米管。钛银合金纳米管不仅可以明显抑制金黄色葡萄球菌的粘附,也可以将绝大部分粘附的细菌杀灭。钛银合金纳米管具有良好的长期抗菌性,浸泡一个月后,其抗菌性仍能达到:1%钛银合金纳米管为95%±2.5%,2%钛银合金纳米管为98%±1%,4%钛银合金纳米管为91%±2.1%。但在钛银合金纳米管周围未发现抑菌环。  (3)虽然钛银合金纳米管的生物相容性显著低于钛纳米管(P<0.05),但与光滑钛对比时,2%钛银合金纳米管的生物相容性仍是令人满意的。其中,2%钛银合金纳米管表面的细胞粘附、形态、早期分化以及抑制细胞凋亡的能力与光滑钛相比无统计学差异(P>0.05);同时2%钛银合金纳米管表面的细胞活性以及增值能力明显优于光滑钛(P<0.05);而1%和4%钛银合金纳米管的生物相容性则弱于光滑钛(P<0.05);钛银合金纳米管的生物相容性受银含量的影响,体外生物相容性优劣的顺序是:2%钛银合金纳米管>4%钛银合金纳米管>1%钛银合金纳米管。在体内试验中,Micro-CT证明1周以及4周时(1%,2%和4%)钛银合金纳米管周围的骨总量与光滑钛无显著差异(P>0.05),但在2周时,2%和4%钛银合金纳米管要显著高于光滑钛(P<0.05);在HE实验中,1、2、4周时2%以及4%钛银合金纳米管周围的骨量与光滑钛之间均无明显差异(P>0.05),而1%钛银合金纳米管在4周时的周围骨量显著低于光滑钛(P<0.05);在免疫组化实验中,1周时1%钛银合金纳米管周围BMP-2的表达量与光滑钛之间无差异(P>0.05),但2%和4%钛银合金纳米管则显著高于光滑钛(P<0.05);在2周时,1%钛银合金纳米管周围BMP-2的表达量显著低于光滑钛(P<0.05),而2%和4%钛银合金纳米管则显著高于光滑钛(P<0.05);在4周时,1%钛银合金纳米管周围BMP-2的表达量显著低于光滑钛(P<0.05),但2%和4%钛银合金纳米管与光滑钛之间无差异(P>0.05)。  结论:  (1)阳极氧化技术可以在钛银合金表面制备钛银合金纳米管,并控制其表面形貌和结构参数;(2)钛银合金纳米管具有优异的长期、短期抗菌性,可以有效抑制菌膜形成,其中2%钛银合金纳米管的抗菌性最强;(3)钛银合金纳米管的生物相容性受银含量的影响,2%钛银合金纳米管的生物相容性与光滑钛相似,无细胞毒性;(4)2%钛银合金纳米管可以作为下一代抗菌假体的备选方案。
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