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目的:为提高抗菌肽的表达,将抗菌肽基因Aurein1.2以同向串联方式连接成多拷贝基因,构建多拷贝基因的克隆重组体和表达重组体,为大量制备Aurein1.2奠定基础。
方法:分别合成含相同粘性末端的Aurein1.2单拷贝基因、EcoRⅠ前接头及SalⅠ后接头。单拷贝基因分别与前、后接头连接,通过控制基因和接头加入的量及时间,可得到两侧含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的同向串联多拷贝基因,选取5个拷贝数的基因,将其克隆到质粒pUC18中,构建出克隆重组质粒pUC18-5A,通过CaCl2法转化到大肠杆菌DH5α中,利用α-互补初步筛选出阳性重组子,进一步用PCR、酶切、DNA测序鉴定重组子。挑取测序正确的阳性重组子,用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切出目标片段再亚克隆到质粒PGEX-4T-1中,构建出表达重组质粒PGEX-4T-1-5A,通过CaCl2法转化到大肠杆菌BL21中,Amp初步筛选出含阳性重组子的工程菌,进一步用酶切鉴定重组子。
结论:1、该基因串联的方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因;2、本研究成功构建了含5拷贝Aurein1.2基因的克隆重组质粒pUC18-5A;3、本研究成功构建了含5拷贝Aurein1.2基因的表达重组质粒PGEX-4T-1-5A;4、为进一步研究和大量制备Aurein1.2创造了前提。