在生命体中存在的蛋白质由20种天然氨基酸组成,具有广泛的种类和作用,是生物体行使其功能最重要的大分子之一。近年来,利用非天然氨基酸(Unnatural amino acid,UAA)标记蛋白位点,对蛋白进行修饰的方法得到广泛应用。通过不同方法将UAA引入到蛋白中,为人们进一步了解蛋白质结构、蛋白间相互作用、蛋白动力学以及修饰改造蛋白质等方面研究提供了行之有效的方法。本论文共分为四章。第一章首先介绍了非天然氨基酸的合成方法,即通过有机合成或通过酶催化法合成非天然氨基酸。有机合成法是大量获得(毫克级到克级)非天然氨基酸的有效手段。而酶催化法利用TPL酶或其突变体,用于一些酪氨酸类似非天然氨基酸的合成,是有机合成法的补充。然后,依据非天然氨基酸功能介绍他们的分类情况,包括化学活性类、翻译后修饰类、生物物理探针类、金属螯合类等。通过已有报道,阐明了非天然氨基酸的重要性。最后,简要介绍了非天然氨基酸标记蛋白质的方法,主要是氨基酸特异性和位点特异性表达含有非天然氨基酸的蛋白质。虽然化学合成法是获得均一性蛋白质的不错选择,但多数报道中,获得非天然氨基酸标记的蛋白质方法主要是通过细胞表达获取。第二章首先介绍了光敏非天然氨基酸(photo-caged amino acid)的应用。利用赖氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸侧链的化学活性与邻硝基苄基类基团连接,得到含有photo-cage的非天然氨基酸。它们通过位点特异性引入目的蛋白的活性位点后,可以封闭蛋白酶的活性。经过紫外光照射可以将光敏感基团脱除,从而得到和天然蛋白酶无任何差异的活性蛋白酶,达到调控酶活性的目的。该方法可以调控蛋白表达、信号传导等多种生物过程。之后介绍了由酪氨酸发展得到的光敏感非天然氨基酸oNBTyr,讲述了 oNBTyr利用密码子扩增方法位点特异性引入蛋白的发展过程。第三章中,先简单介绍了液体核磁共振技术应用于蛋白质研究的基本方法。在核磁共振研究中,经常只需要针对一个位点的信号变化进行分析即可。所以在拿到相关谱图后,我们往往需要进行繁琐且复杂的信号峰归属工作。如果能发展出一种在不影响蛋白结构和功能的情况下,对蛋白单一位点进行同位素标记的方法,那么将极大地简化核磁分析过程。以酪氨酸位点的核磁分析为例,我们首先优化了 oNBTyr的化学合成,合成产率由原先的21%提高至81%。随后,利用15N-oNBTyr分别标记在GB1和PYL10蛋白的酪氨酸位点(GB1-33Tyr和PYL10-116Tyr),并在光照脱光敏基团后进行核磁数据采集和分析。证明了利用光敏非天然氨基酸进行蛋白质酪氨酸位点同位素标记的可行性。为其他类似的光敏非天然氨基酸应用提供了借鉴。第四章介绍了已有报道的荧光类非天然氨基酸的化学合成方法以及他们的应用。着重介绍了非天然氨基酸Anap的发展,以及L,D-Anap的合成方法。Anap首次被Peter Schultz于2009年报道,其合成路线复杂、产率低(8.5%),而且其合成得到的是D,L-Anap(外消旋体)。我们设计出了合成手性异构的L-Anap合成路线,以2-溴代萘和N-三苯甲基-丝氨酸甲酯为起始原料,经过八步反应步骤,合成关键一步利用光延反应进行荧光分子和氨基酸手性中心链接,形成新的C-N键,完成L-ANAP合成。总产量为15.3%。该合成工作的完成,为Anap的应用做出了贡献。