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基因芯片显示番茄细菌性叶斑病原菌Pseudomonassyringae pv.tomato DC3000(PstDC3000),干旱、冷和盐等逆境处理及在开花关键基因lfy突变体中都能够上调AtST39(At3946110)基因表达;AtMPA(Atlg05577)在拟南芥单核花粉粒向三核花粉发育的过程中特异性表达。但是.AtST39参与胁迫和AtMPA在介导花粉发育的分子机制知之甚少。我们主要对AtST39进行了探索研究,结果如下:
(1)NCBI数据库显示YWC基因家族共有185个蛋白家族成员。经蛋白多序列比对,发现YWC蛋白家族含有三个高度保守的模体。生物信息学预测YWC蛋白家族成员可能受到Auxin调节,具有半胱氨酸内切酶水解活性,能与APG6结构域相互作用。AtST39和AtMPA蛋白都含有两个未知功能的YWC结构域。
(2)转PAtST39::GUS基因植株GUS染色结果显示,AtST39在维管束组织、花粉、子叶和成熟叶中表皮毛表达,同时在侧根起始区域特异性表达。荧光显微镜下观察35S::AtST39-GFP转基因植株幼苗根部发现该蛋白定位在细胞质和细胞膜,同时在烟草中的瞬时表达进一步确认了AtST39蛋白定位在细胞细胞质和细胞膜。从N端截短的AtST39蛋白35S::AtST39 NIT-GFP和35S::AtST39 N2T-GFP在成熟的根中发现都定位在细胞核,说明AtST39蛋白N端不影响其入核。生物信息学预测AtST39存在两个已知的剪切变异体,通过设计特异性引物,半定量PCR发现AtST39还存在一个新的剪切体。通过测序发现,AtST39新的剪切体第一个内含子没有发生选择性剪切。进一步研究表明盐和冷胁迫能提高新的选择性剪切体基因表达丰度,提示新的选择性剪切体参与了盐和冷胁迫应答。
(3)利用三引物法和双引物法在基因组水平对Atst39,Atst39h,Atmpa和ufc的T-DNA插入突变体进行鉴定,通过RT-PCR鉴定并获得了AtST39基因T-DNA插入突变体纯合体,而atst39h,Atmpa插入突变体鉴定结果显示没有敲除AtST39H和AtMPA。
(4)AtST39过量表达株系,T-DNA插入突变体纯合株系与野生型相比,在盐和干旱胁迫中表现萌发率下降。突变体对干旱胁迫的敏感性可以被内源ABA合成抑制剂氟啶酮恢复。实时荧光定量PCR发现突变体与野生型相比,能够激活更多的ABA响应基因RD29B和RD29A转录表达,同时反馈抑制ABA合成关键基因NCED3转录。首先,荧光定量PCR结果显示ABA可以诱导AtST39基因的表达。其次,ABA处理Atst39突变体,过量表达株系和野生型时,发现突变体中的ABA响应基因如RD29B和NCED3基因表达下调,而过量表达株系能够迅速上调RD29B基因表达。再次,突变体与野生型相比,在不同浓度的ABA处理下,种子萌发率下降,并且ABA能够强烈地抑制突变体的主根伸长,下胚轴的伸长和子叶的生长,这种表型可以通过加入细胞分裂素和转移到不含ABA的1/2MS培养基中部分恢复。以上结果表明AtST39在盐和干旱胁迫条件下依赖于ABA调控种子萌发和非依赖于ABA的信号途径来调控幼苗对逆境的响应。最后,用200gM H2O2处理野生型拟南芥,能够在1h内迅速诱导AtST39基因表达并达到最大值,因此,我们推测AtST39作为ROS信号分子,负向调控脱落酸与细胞分裂素抑制主根、下胚轴的伸长和子叶变绿过程。
(5)在pad3,wrky11,和coil-J突变体中的AtST39基因表达下调,相反npr1中AtST39基因表达上调。用P.syringae pv.tomato DC3000处理植株后发现,突变体的病斑与野生型和AtST39过量植株相比,Atst39 T-DNA纯合突变体的病斑明显缩小且突变体接菌后能够显著激活病程相关基因的表达,同时也能增强PAD3和WRKY11基因表达,表明AtST39在拟南芥响应P.syringaepv.tomato DC3000病原菌的过程中起负向调控作用。
(6)我们构建了原核His-AtST39融合表达载体pET28a-AtST39,并对AtST39蛋白进行了BL21(DE3)菌株原核表达,通过优化表达条件,发现该蛋白主要以包涵体形式存在,少量存在上清中。
(7)另外,我们对AtMPA基因表达模式有初步的探索:生物信息学预测拟南芥成熟花粉中大量表达基因AtMPA(Atlg05577)在花粉中特异表达,并且Genevestigator V4提示AtMPA在JA生物合成途径opr3突变体中基因表达量显著下调。共表达数据库分析显示.AtMPA与脂肪酶和果胶酶基因共表达。PL,ACE启动子预测结果表明AtMPA启动子存在花粉特异性表达元件CARGCW8GA、POLLENlL,ELAT52、根器官特异元件OSE2ROOTNODULE和多个生长素响应元件,转AturA::GUS植株组织化学染色进一步证实了AtMPA在成熟花粉粒中大量表达,同时在子叶叶尖和侧根的起始区域与伸长区特异性表达,这些结果提示AtMPA可能具有水解活性,并参与JA介导的花粉发育和Auxin介导的侧根发育。