癌症是威胁人类生命的主要杀手之一,世界上许多国家癌症发病率和死亡率均呈逐年上升趋势,预计到2030年,因癌症死亡人数将超过1100万。在临床应用的200多种化疗药物中,大部分属于细胞毒类抗癌药物,他们在杀伤肿瘤细胞的同时也会影响正常细胞的生理功能从而带来一系列严重毒副反应,加上化疗药物耐药性等问题成为限制化疗药物应用的主要原因。因此寻找高效低毒的新型非细胞毒性化疗药物成为当今抗肿瘤药物研发的大趋势。本课题研究的徳氮吡格（Tetrazanbigen, TNBG)是自主创新设计合成的含有“2-苯基萘三环共平面结构”的氮杂甾烷类化合物,已获中国发明专利授权。在国家自然科学基金(基金编号:30371612和30772595)资助下,经体外实验发现:TNBG对实体瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性,且与其他常用抗肿瘤药物无交叉耐药性;再经体内实验证实,TNBG能延长荷瘤小鼠和荷瘤兔生存期,并且发现在TNBG治疗的肿瘤组织细胞内有大量脂质聚集;进一步经基因芯片、蛋白质组学和其他相关分子生物学实验发现,TNBG一方面可能通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)靶点和激活固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)靶点或通路增加内源性甘油三酯、胆固醇等脂质合成,另一方面可能抑制微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)转运脂质,从而引起肿瘤细胞内脂质聚集,为此,本课题组提出了TNBG以脂代谢相关的PPARγ、SREBPs以及MTTP等为靶点的非细胞毒性抗肿瘤作用的新观点。为了确证这一观点,本课题组采用尺寸排阻色谱-高效液相色谱法(Size exclusion chromatograph HPLC, SEC-HPLC),考察了体外表达全长人PPARγ重组蛋白受体与配体TNBG的结合影响,经实验发现,TNBG与PPARγ结合的Kd为1000nM,这表明TNBG与PPARγ的结合是特异性的。基于此,本文为了进一步研究TNBG在细胞水平与PPARγ靶点结合的情况,探讨TNBG的“脂毒性”抗肿瘤药效学及其作用机制,主要开展的工作和结论如下:1在抗肿瘤体外药效学实验中,选用了实体瘤和非实体瘤等六株细胞为模型细胞,采用MTT法,经实验发现TNBG对肿瘤细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性,其半数抑制浓度(IC50)在2-9μg/ml之间。其中TNBG对人肝癌细胞株QGY-7701的IC50值最低,为2.13±0.65μg/ml(n=3)。由此表明TNBG体外抗瘤谱较广且活性较强。2在抗肿瘤体内药效学实验中,构建了裸鼠人肝癌细胞株QGY-7701异种移植瘤模型,经实验发现:①用TNBG(剂量1.5mg/kg)连续治疗5周后,对人肝癌细胞株QGY-7701裸鼠移植瘤抑瘤率为87.02%;②TNBG治疗组裸鼠的体重、免疫功能、肝功能、肾功能和血脂水平与对照组比较无显著性差异(P>0.05);③采用脂质特异性苏丹Ⅲ染色实验发现,只有TNBG治疗组肿瘤组织细胞内有大量脂质聚集,而对照组和TNBG治疗组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、主动脉切片显示均无脂质聚集;④给药期间,TNBG治疗组裸鼠的生命体征平稳,精神、进食、排便等活动正常。由此表明TNBG在人肝癌细胞株QGY-7701裸鼠异种移植瘤模型上能特异性地引起肿瘤组织细胞内产生脂质聚集,从而使肿瘤细胞因“脂毒性”死亡,这就表明TNBG抗肿瘤的“脂毒性”作用具有肿瘤细胞靶向性,体内抗肿瘤活性较强且毒副作用较小。3采用RNA干扰技术,建立了人肝癌细胞株QGY-7701的PPARγ表达抑制的“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞模型。通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法,在mRNA水平上发现PPARγ被抑制了80%;采用Western blot技术,在蛋白水平上发现PPARγ被抑制了71%。干扰效果最好的干扰序列为“TCTTCCGGAGAACAATCAG”,并将干扰效果最好的序列转染得到的细胞命名为“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞。这就为TNBG抗肿瘤作用机制研究和基于PPARγ靶点的药物筛选提供了可靠的细胞模型。4在体外肿瘤细胞脂质聚集实验中,①采用脂质特异性油红O染色法,从脂质定性角度发现TNBG可以诱导人肝癌细胞株QGY-7701产生大量脂质聚集,且随TNBG处理时间延长和浓度增加,细胞内脂质聚集不断增加,并观察到肿瘤细胞生长受到明显的抑制。②采用MTT方法,考察了TNBG对“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞增殖的影响,经实验并计算得到TNBG对“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞的IC50值为3.21±0.10μg/ml(n=3),而TNBG对人肝癌细胞株QGY-7701的IC50值为2.13±0.65μg/ml(n=3),二者有显著性的差异(P<0.05),这表明了人肝癌细胞株QGY-7701中PPARγ表达抑制减少了TNBG诱导的肿瘤细胞内的脂质聚集,显著降低了TNBG引起“脂毒性”导致肿瘤细胞死亡的作用。③采用全自动生化分析方法对脂质成分进行定量检测发现,(1)与人肝癌细胞株QGY-7701对照组相比,TNBG(浓度2.0μg/ml)处理人肝癌细胞株QGY-7701(72h)后,甘油三酯(TG)水平为346.43 nmol/mg,增加的比例为69.12%,总胆固醇(TC)水平为38.99 nmol/mg,增加的比例为63.00%,游离脂肪酸(FFA)水平为159.52 nmol/mg,降低的比例为28.82%,脂质总量(以TG、TC、FFA总量计)增加的比例为20.33%;(2)与TNBG处理的人肝癌细胞株QGY-7701相比,TNBG处理“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞(72h)后,TG水平为306.64 nmol/mg,减少的TG量占TNBG引起TG增加量的28.10%,TC水平为35.44 nmol/mg,减少的TC量占23.56%,FFA水平为168.04 nmol/mg,增加的FFA量占13.19%,由于PPARγ表达抑制,减少的脂质总量(34.81 nmol/mg)占TNBG诱导的脂质聚集总量(92.08nmol/mg)的比例为37.80%。这表明TNBG通过PPARγ途径引起肿瘤细胞内脂质聚集是比较重要的途径之一。(3)与TNBG处理的人肝癌细胞株QGY-7701相比,TNBG处理“psiHIVU6-PPARγ- QGY”细胞(72h)后,脂质聚集总量增加量(57.27 nmol/mg)占TNBG引起的脂质聚集总量(92.08nmol/mg)的比例为62.20%。这就表明当PPARγ表达抑制后,TNBG还可通过其他途径引起肿瘤细胞内的脂质聚集,并且这些途径也具有十分重要的作用。从上述定性和定量实验结果显示,TNBG诱导肿瘤细胞内脂质聚集产生的“脂毒性”是TNBG产生抗肿瘤作用的主要原因,TNBG所致的脂质聚集作用可能是由激活PPARγ靶点以及其他靶点或通路(如激活SREBPs通路增加脂质、抑制MTTP靶点减少脂质转运等)等多靶点或多通路相互协同所致。5采用流式细胞术(FCM),考察了TNBG对人肝癌细胞株QGY-7701和“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞周期分布和凋亡诱导作用的影响。经实验发现TNBG(浓度2.0μg/ml)处理(72h)后,在人肝癌细胞株QGY-7701和“psiHIVU6-PPARγ-QGY”细胞上均可检测到S期细胞阻滞和凋亡现象,但PPARγ表达抑制后TNBG引起的细胞周期阻滞和凋亡均显著降低(P<0.05)。由此表明TNBG诱导肿瘤细胞周期阻滞和诱导凋亡作用具有PPARγ依赖性。综上所述,经体内外药效学实验证明,TNBG具有较强的抗肿瘤活性和较低的毒副作用,其抗肿瘤作用机制为通过激活PPARγ依赖性靶点以及其他通路或靶点(如激活SREBPs通路增加脂质、抑制MTTP靶点减少脂质转运等)引起肿瘤细胞内脂质聚集增加,导致肿瘤细胞的“脂毒性”,使肿瘤细胞周期阻滞和诱导凋亡,最终导致肿瘤细胞死亡。这就预示着,TNBG是一个多靶点的以特异性引起肿瘤细胞内脂质聚集产生“脂毒性”抗肿瘤的新型非细胞毒性抗肿瘤药物。