柴胡含药血清对mTORC1/4E-BP1轴介导肺成纤维细胞胶原表达的作用

来源 :湖南中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:peggy721
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目的:通过网络药理学和细胞实验探讨柴胡治疗特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)的作用和机制。方法:通过中药系统药理学数据库获得柴胡活性成分,通过Swiss Target Prediction数据库预测柴胡活性成分的作用靶点。从Comparative Toxicogenomics、Gene Cards、Dis Ge NET数据库获得IPF疾病相关基因。通过韦恩图取交集获得柴胡治疗IPF的靶点。通过String数据库及Cytoscape软件构建柴胡治疗IPF靶点的蛋白质相互作用网络。通过Me tascape数据库对靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEG G)富集分析。以转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,T GF-β1)刺激后的人胚肺成纤维细胞(Human fetal lung fibroblast 1,H FL1)作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法检测TGF-β1和柴胡含药血清对细胞增殖率的影响;用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q PCR)法检测对Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、羟脯氨酸m RNA表达的影响;用流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;用免疫荧光法和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测对m TORC1/4E-BP1轴的影响。结果:(1)通过网络药理学的方法,共获得柴胡活性成分17个,预测得到柴胡作用靶点381个,IPF疾病相关基因5128个,柴胡治疗IPF靶点256个。柴胡治疗IPF靶点构建的蛋白相互作用网络,含有256个节点,2555条边,节点平均自由度为20。关键节点按自由度降序排列依次为TNF、AKT1、SRC、EGFR、MAPK3、HSP90AA1、CASP3、PGS2、MMP9和MTOR。GO和KEGG富集分析结果显示柴胡治疗IPF主要与PI3K/Akt等通路有关。(2)CCK-8检测结果显示:HFL1细胞经过TGF-β1处理24 h后,各浓度组组间细胞增殖率差异有统计学意义(p<0.05),而处理48h和72 h后,各浓度组组间细胞增殖率差异没有统计学意义(p>0.05)。相较于空白组,5 ng·m L-1和10 ng·m L-1 TGF-β1组细胞增殖率显著升高(p<0.001)。20 ng·m L-1TGF-β1组细胞增殖率显著低于10 n g·m L-1组(p<0.001)。TGF+20%空白血清组相较于20%空白血清组细胞增殖率显著上升(p<0.05)。与TGF+20%空白血清组相比,TGF+5%和TGF+10%柴胡含药血清组细胞增殖率有下降趋势,但差异没有统计学意义(p>0.05)。TGF+15%和TGF+20%柴胡含药血清组细胞增殖率显著低于TGF+20%空白血清组(p<0.01)。(3)流式细胞术检测结果显示:TGF组与空白组相比早期凋亡及总凋亡细胞占比均降低,正常细胞占比升高(p<0.01),晚期凋亡细胞占比无差异(p>0.05)。TGF+柴胡含药血清组与TGF组相比早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡细胞占比均升高,正常细胞占比降低(p<0.001)。TGF+AZD8055组与TGF组相比晚期凋亡细胞占比升高(p<0.001),正常细胞、早期凋亡及总凋亡细胞占比差异无统计学意义(p>0.05)。(4)q PCR检测结果显示:与空白组相比,TGF组CollagenⅠ、Col lagenⅡ、HYP m RNA表达量均显著上升(p<0.001)。与TGF组相比,TGF+柴胡含药血清组和TGF+AZD8055组CollagenⅠ、CollagenⅡ、HYP m RNA表达量均显著减少(p<0.001)。(5)WB法检测结果显示:TGF组与空白组相比,4E-BP1磷酸化水平显著上升(p<0.01),而Raptor磷酸化水平差异没有统计学意义(p>0.05)。与TGF组相比,TGF+柴胡含药血清组4E-BP1磷酸化水平降低,Raptor磷酸化水平升高(p<0.05)。与TGF组相比,TGF+AZ D8055组4E-BP1磷酸化水平降低(p<0.05),Raptor磷酸化水平差异没有统计学意义(p>0.05)。(6)免疫荧光法检测结果显示:TGF组与空白组相比Raptor蛋白表达水平显著升高,4E-BP1磷酸化水平升高(p<0.001)。TGF+柴胡含药血清组、TGF+AZD8055组与TGF组相比,Raptor蛋白表达水平降低,4E-BP1磷酸化水平降低(p<0.001)。结论:(1)网络药理学预测柴胡治疗IPF可能与PI3K/Akt通路有关。(2)柴胡含药血清能抑制TGF-β1诱导的HFL1细胞增殖,促进细胞凋亡,减少胶原表达,其作用机制可能与m TORC1/4E-BP1轴有关。
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