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葎草(HumulusscandensL.),大麻科(Cannabaceae),葎草属,是一种常见的雌雄异株杂草。葎草雄株的遗传组成为2n=17,具有三个较大的性染色体即XY1Y2,雌株的遗传组成为2n=16,性染色体为XX,可以作为研究雌雄异株植物性别决定、性别分化,尤其是性染色体起源与进化的模式材料。然而,目前关于葎草的性别决定机制、性染色体的起源与进化模式仍不清楚。
本文以葎草为材料,首先葎草的性染色体的形态特征、性染色体在减数分裂中的配对及分离进行观察,分析X和Y染色体形态及减数分裂中的分离行为特征。其次采用ISSR分子标记和RAPD分子标记分别对葎草进行雌雄株之间的差异比较研究,筛选与性别相关的分子标记,将ISSR分子标记和RAPD分子标记转化成稳定性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)标记,并应用Soutnem杂交技术初步分析其在基因组中的分布特征,为通过色体荧光原位杂交定位以及探寻性染色体起源与进化的线索提供一定的实验基础。研究取得的结果如下:
1、以葎草花粉母细胞为材料,采用传统的核型分析方法对其减数分裂过程中终变期的性染色体进行了研究,结果发现葎草花粉母细胞在减数分裂终变期存在7个二价体和1个三价体,有的三价体末端结合,有的三价体其中两条整体配对并与第三个末端配对,推测雄株有三条性染色体。
2、利用简单重复序列间扩增(Inter-simpiesequencerepeat,ISSR)技术对葎草雌雄株性别的基因组差异进行了比较研究。在62条ISSR引物中,40个引物均扩增出了稳定的条带,共产生了302条带。引物164在葎草中扩增出一条雄性连锁条带,经克隆测序,发现该片段长度为553bp,AT含量为64.3%,属于富含AT的序列,根据测序结果设计特异引物,成功的将该标记转化为稳定性更好的SCAR标记。
3、利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术对葎草雌雄株的性别差异进行了比较研究。在所有筛选的引物中,引物S2142在葎草中扩增得到一条雄性相关的RAPD标记,它的长度为762bp,AT含量为54.7%。根据序列分析结果设计特异引物将该片段转化为重复性和特异性更好的SCAR标记,经检测发现这个标记是非常稳定的雄性葎草的分子标记,并经Southern杂交分析发现该片段为基因组中一低拷贝重复序列。