课题一、DLX2表达增高导致胶质母细胞瘤高增殖表型并与病人预后差相关　　研究背景与目的:胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)是成人最常见的恶性脑肿瘤。患有胶质母细胞瘤的患者通常预后较差，中位生存期为14至16个月。尽管病理学特征极为相似，胶质母细胞瘤却是一种异质性肿瘤，生物学行为具有较大可变性，治疗反应和预后显著不同。目前脑胶质瘤的分类和分级主要依据2000年WHO颁布的分类方法，诊断主要依据组织学的检测结果。而患者预后的巨大差别正说明这种诊断方法的不足。现阶段分子靶向治疗已经成为肿瘤治疗的发展方向，基于组织病理的分型标准显然不能满足这一治疗手段的应用。因此，亟需基于分子病理的新的分型标准，寻找胶质母细胞瘤的诊断及预后分子标记，对临床治疗提供指导。　　人的远端缺失同源异型盒基因DLX(distal-less homeobox)家族编码的同源转录因子参与颅面形成和前脑抑制神经元的分化、存活控制。DLX2作为该家族的成员之一，可通过直接诱导表皮生长因子受体(EGFR)配体β细胞素的表达而诱导促有丝分裂的EGFR通路激活。DLX2的功能与细胞周期阻滞和凋亡等细胞活动相关。有文献报道DLX2基因的过表达促进黑色素瘤细胞的生长和代谢。DLX2基因在胶质母细胞瘤中的过表达及其功能尚未有文献报道。　　在该研究中，我们利用中国人脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)数据库提供的83例胶质母细胞瘤样本，运用基因表达谱芯片检测DLX2基因的表达水平，并分析其表达水平与现有的分子分型和患者生存之间的关联。　　方法:应用总RNA提取试剂盒提取83例冻存的原发性胶质母细胞瘤标本的总RNA; Agilent人全基因组表达谱芯片检测mRNA表达情况;对芯片结果进行分析，包括应用COX回归评估每个基因mRNA表达水平与患者总体生存的关联，分层聚类法(hierarchical clustering，HCL)对前1000个与预后最相关的探针进行聚类分析，SAM法筛选表达差异基因，Kaplan-Meier生存分析，基因富集性分析等;GO(Gene Ontology)分析发现DLX2是最显著的预后因子，对其进行深入研究;免疫组化法检测42例随机原发性胶质母细胞瘤样本DLX2表达水平;选取胶质母细胞瘤细胞系LN229研究DLX2基因表达水平对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响，利用脂质体2000将DLX2 siRNA及对照siRNA转入LN229细胞，Western blot法检测基因敲低效率及下游靶基因cyclinD1表达水平;MTT法研究DLX2基因对细胞增殖的影响。　　结果:芯片分析结果显示，在多于41000个探针的芯片检测结果中，29421个探针的检测结果显示与预后相关(log转换的表达强度值与生存时间的Spearman相关系数r＞0.8或＜-0.8)。分层聚类法将前1000探针代表的913个基因和83个pGBM样本分为2个亚型， C1亚型和C2亚型。GO分析显示C1亚型中，前10个GO术语中有7个术语与神经细胞的分化和发育相关，其中最显著的预后基因是DLX2(P＜0.001，OR=1.744)。DLX2基因过表达与预后相关(低表达vs高表达，77.6周vs44.7周中位生存期，P＜0.001)。应用TCGA和MDA分型系统对我们的数据进行分析，结果显示DLX2基因的高表达和低表达分别与神经元亚型和前神经元亚型相关。LN229细胞中DLX2基因表达水平敲低后，cyclinD1蛋白表达随之降低，细胞增殖下降。　　结论:我们的研究依据83例胶质母细胞瘤表达谱数据，发现了胶质母细胞瘤的2个亚型，并发现DLX2基因是这2个亚型中与患者生存期最密切的基因。DLX2基因的高表达预示着患者预后差，而DLX2基因低表达则预示着患者相对较好的预后。我们利用TCGA和MDA的分型系统分析发现DLX2高表达主要见于神经元亚型，而DLX2低表达主要见于前神经元亚型。我们的结果显示，DLX2基因可作为人胶质母细胞瘤独立的预后分子。DLX2基因的过表达可能通过增加cyclinD1的表达而导致促进胶质母细胞瘤的增殖。　　课题二、PASG转基因小鼠模型研究与PASG单克隆抗体制备　　研究背景与目的:肿瘤DNA甲基化异常自1983年被发现已成为肿瘤发病机理研究的热点。正常细胞中，约70％的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸处于甲基化状态，而在肿瘤细胞中，DNA甲基化状态发生改变，包括全基因组低甲基化及局部启动子区高甲基化现象。基因组DNA甲基化异常可导致基因组不稳定性，如染色质构象异常、转座子激活、原癌基因激活表达以及抑癌基因被抑制表达等。各种类型的白血病中也存在类似的DNA甲基化异常，分子机理不明确。最近有研究发现DNMT3A在22.1％的急性髓细胞白血病(AML)中突变，而突变的DNMT3A影响基因表达的确切机制却不明确。　　PASG基因(Proliferation-associated SNF2-1ike Gene)，即增殖相关的SNF2样基因，该基因是由约翰霍普金斯大学肿瘤研究所Arceci教授实验室首先从急性髓细胞性白血病(AML)细胞系中分离。PASG基因与基因组DNA甲基化状态密切相关。将植物中的同源基因DDM1和小鼠中的同源基因Lsh敲除后，导致全基因组DNA低甲基化状态。PASG基因定位于DNA复制叉中，与DNA甲基转移酶(DNMT1)和增殖细胞核抗原(PCNA)共同作用，协助DNMT1催化新合成的DNA链甲基化。　　PASG基因在白血病中发生突变，其转录本丢失75个碱基，编码25个氨基酸，我们将这一变体表示为PASG(-25)。前期体外研究发现PASG(-25)也处于DNA复制叉中，与PCNA相互结合，不与DNMT1结合，失去协助DNMT1的功能，发挥PASG功能拮抗剂的作用。PASG(-25)可能是白血病DNA低甲基化的原因。然而，只有利用转基因动物模型从体内进行研究才可以验证这一假设:PASG(-25)与DNA低甲基化相关，并进而引发白血病。而且目前还没有非常好用的PASG抗体用于DNA甲基化蛋白复合体的研究。所以该课题研究内容包括二个部分:(一)PASG(wt，-25)转基因小鼠模型制备:我们拟用该模型研究PASG(-25)与DNA低甲基化和白血病的关系;(二)PASG单克隆抗体的制备:制备高质量的PASG(wt)单克隆抗体，用于后续DNA蛋白复合体的研究。　　方法:　　(一)PASG(wt，-25)转基因小鼠模型制备:　　(1) PCR扩增目的基因PASG(wt，-25)，PCR引物设计时在5’端加入MluⅠ和3’端加入NheⅠ酶切位点，并在两端加入Flag和HA标签。　　(2)切胶纯化目的片段;PCR纯化片段与EμSRα载体连接，制备Eμ-PASG(wt)和Eμ-PASG(-25)重组载体。　　(3)转化Trans10感受态细胞，挑取阳性克隆进行质粒小提;酶切鉴定重组载体及测序检测序列正确性。　　(4)Eμ-PASG(wt)和Eμ-PASG(-25)重组载体质粒大提，转染COS7细胞检测重组载体基因表达情况，分别用anti-Flag和anti-HA单克隆抗体进行检测。　　(5)NotⅠ酶切重组载体使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收目的片段。　　(6)南京大学模式动物研究所和中国医学科学院实验动物研究所进行转基因显微注制备转基因小鼠。　　(7)转基因小鼠的筛选鉴定:鼠尾提取基因组DNA，PCR鉴定转基因是否在基因组中整合;子一代鼠分离脾脏细胞和胸腺细胞TRIzol法提取RNA或首建鼠眼眶静脉丛取血提取RNA，RT-PCR检测RNA表达;子一代鼠分离脾脏细胞和胸腺细胞提取总蛋白，anti-Flag和anti-HA抗体进行免疫沉淀，后用Western blot方法对转基因蛋白表达进行鉴定。　　(二)PASG(wt)单克隆抗体的制备:　　(1)本实验室制备的BaculoDirectTM-PASG重组杆状病毒感染sf9细胞制备PASG蛋白。　　(2)利用Ni-NTA纯化系统纯化PASG蛋白，随后进行超滤浓缩。　　(3)PASG蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。　　(4)间接ELISA检测血清效价，抗体滴度达到。　　(5)取PASG蛋白免疫小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合。　　(6)ELISA、Westernblot及免疫沉淀/Western blot对杂交瘤细胞上清进行筛选鉴定，对鉴定的阳性克隆进行亚克隆筛选。　　(7)夹心ELISA检测抗体亚类。　　(8)PASG(-25) in pcDNA3.1转染COS7制备PASG(-25)蛋白，检测单抗是否可以用于检测PASG(-25)蛋白。　　(9)扩增阳性单克隆杂交瘤细胞株接种小鼠腹腔制备腹水及腹水的鉴定。　　(10)冻存全部阳性杂交瘤细胞。　　结果:　　(一)PASG(wt/-25)转基因小鼠模型制备:2次成功构建Eμ-PASG(wt)和Eμ-PASG(-25)转基因载体;重组载体转染COS7细胞，Western blot检测蛋白表达良好;显微注射共获得转基因首建鼠100只，RT-PCR的方法检测转基因子代鼠或首建鼠RNA表达，共有4只Eμ-PASG(wt)小鼠检测到RNA表达;免疫沉淀/Western blot的方法未检测到转基因蛋白的表达。　　(二)PASG(wt)单克隆抗体的制备: BaculoDirectTM-PASG重组杆状病毒感染sf9成功表达PASG蛋白;免疫5只小鼠，小鼠血清效价达到10-5以上;进行2次细胞融合实验;用ELISA和Westernblot方法筛选到5株较好的阳性杂交瘤细胞株，2H6，2B10，5A43，1C3和2G8阳性细胞株。亚克隆获得4株单克隆杂交瘤细胞株(2H6，2B10和1C3，2G8)，5A4株抗原抗体反应弱，亚克隆未获得单克隆，冻存备用。2H6杂交瘤上清可用于免疫沉淀检测，亚类测定为IgG1。2H6杂交瘤上清可通过Western和免疫沉淀的方法检测到PASG(-25)蛋白。2H6，1C3和2G8单克隆杂交瘤细胞成功制备腹水。　　结论:　　(一)PASG(wt，-25)转基因小鼠模型制备:2次成功构建Eμ-PASG(wt)和Eμ-PASG(-25)转基因载体，转染COS7细胞证明载体在体外可以表达良好。显微注射的方法制备转基因小鼠，只有4只Eμ-PASG(wt)小鼠检测到转基因RNA水平表达，未检测到转基因蛋白表达。　　(二)PASG(wt)单克隆抗体的制备:成功筛选到4株anti-PASG单克隆抗体，抗体可用于ELISA和Western blot检测，包括2B10，2H6，1C3和2G8。2H6株可用于Western blot和免疫沉淀法检测PASG(-25)蛋白。2H6亚类测定为IgG1。2H6，1C3和2G8单克隆杂交瘤细胞株接种小鼠腹腔成功获得PASG腹水抗体。PASG单克隆抗体的成功制备为后续研究PASG在肿瘤中的表达情况和DNA甲基化蛋白复合体的研究提供了有效工具。