论文部分内容阅读
红松(Pinus koraiensis)是我国东北地区极其重要的优质用材树种,也是发展前景巨大的坚果经济林树种。进行红松体细胞胚胎发生和不定芽发生研究,既可以为其生物学研究提供有效组培体系,又可以直接用于优良种质材料的无性扩繁。但是,目前有关红松组织培养的研究资料很少见。本项研究以红松成熟和未成熟合子胚为试验材料,对红松愈伤组织诱导和增殖的影响因素,及不定芽发生的条件进行了初步研究,以便为体细胞胚胎发生和通过不定芽途径进行植株再生奠定基础。主要结果如下:(1)红松愈伤组织的诱导与合子胚外植体采集时期密切相关。在6月下旬至7月下旬取材时,合子胚处于前子叶期及子叶期,此时愈伤组织不易诱导和保持,有效愈伤诱导率几乎为0;8月中旬至9月下旬取材时,合子胚趋近成熟时期,有效愈伤组织诱导率明显提高,但较容易转为非胚性愈伤组织;10月份取材时,合子胚处于成熟期,此时有效愈伤组织诱导的频率和质量都很高,且能较长时间的保持旺盛分化和鲜活状态。(2)不同的培养基对有效愈伤组织的诱导效果不同,初始诱导应选用盐浓度较高的LM培养基使外植体完全脱分化,反复继代后可以产生有效愈伤组织;供试的其他培养基继代后极少产生有效愈伤组织。(3)不同的激素组合和浓度配比对有效愈伤组织的诱导率影响不同,2,4-D是愈伤组织启动的不可或缺的植物生长调节剂,其作用远远大于NAA。在LM+2 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-16-BA的诱导培养基中加入0.5 mg·L-1 KT或0.5 mg·L-1 TDZ,可显著提高有效愈伤组织的诱导率(可达75.7%)。(4)对合子胚外植体进行预处理对愈伤组织的诱导有明显促进效果。经不同浓度的蔗糖、PEG 6000、甘露醇溶液浸泡24 h后,愈伤组织2周后产生,愈伤组织多为透明疏松或白色半透明状态,可长时间(60 d左右)保持鲜活状态。3种处理后的合子胚平均有效愈伤组织诱导率90%以上,但后期继代大多转为非胚性愈伤组织。(5)在有效愈伤组织的增殖培养阶段,需降低生长素和细胞分裂素的浓度。添加KT的增殖效果好于6-BA。较好的增殖继代培养基为LM+0.3 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1KT。LM+0.01 mg·L-1 TDZ也可使有效愈伤增殖率达到较高水平(60%)。(6)ABA、PEG 6000和甘露醇在一定浓度时对愈伤组织的增殖有促进作用。不添加激素的LM培养基,加入5 g·L-1 ABA时极显著提高增殖率;加入10~15 g·L-1 PEG6000或0.5 g·L-1甘露醇时显著提高增殖率。3种添加物显著提高增殖率均在30%左右。(7)红松离体胚的萌发适宜培养基为DCR或BM培养基,暗培养情况下10 d左右可见胚根伸长。不定芽诱导的适宜培养基是DCR+0.5 mg·L-1 6-BA,暗培养较适宜,最佳外植体为完整的成熟合子胚。