背景:近几十年来,随着生活条件的改善及人口老龄化的发展,冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率呈现越来越高的趋势。高血压、糖尿病及高脂血症是诱发冠心病的主要因素,其中高脂血症及其导致的动脉粥样硬化是研究的热点之一。巨噬细胞的脂质代谢失衡学说目前已成为学术界的共识,巨噬细胞在脂质负荷过重的情况下吞噬氧化的低密度脂蛋白,使胆固醇在巨噬细胞内堆积,最后将巨噬细胞转化为泡沫细胞,胆固醇在巨噬细胞内聚积是形成动脉粥样硬化的重要环节之一。抑制巨噬细胞的泡沫化以及血管内壁的脂质沉着,在动脉粥样硬化的防治过程中有着重大的临床意义。目前动脉粥样硬化的治疗主要从抑制脂质流入和促进脂质流出两方面着手,抑制脂质流入目前以他汀类药物的应用为主,他汀类降血脂药物在动脉粥样硬化的治疗中占有举足轻重的作用,既往的研究显示他汀类药物除了能降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白之外,还能升高高密度脂蛋白,稳定动脉粥样硬化斑块,改善血管内皮功能的作用。促进脂质从巨噬细胞内流出即胆固醇逆向转运,它是将巨噬细胞内的胆固醇转运至肝脏,经肝脏代谢转化为胆汁酸盐继而排除体外的过程,越来越多的学者将研究的重点放在胆固醇逆向转运上,他汀类药物是否能够促进胆固醇逆向转运目前仍是学术界争论的要点。载脂蛋白M(ApoM)是一种最近被发现的新型的载脂蛋白,被证明与高密度脂蛋白介导的胆固醇逆向转运密切相关,它与胆固醇逆向转运关键步骤pre-βHDL的形成有关。有研究报道,他汀类药物通过增加体内ATP结合转运蛋白A1(ABCA1)和清道夫受体B类Ⅰ型(SRBI)这些HDL受体的表达继而促进胆固醇逆向转运作用,同时也能调控HepG2细胞内ApoM的表达,据此我们推测他汀类药物抗动脉粥样硬化的机制可能与ApoM,ATP结合转运蛋白以及清道夫受体相关。因此我们设计实验阿托伐他汀分别刺激HepG2细胞和THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,并用刺激后的HepG2细胞上清液与泡沫细胞共培养,观察共培养对泡沫细胞内脂质及胆固醇流出的影响,探索阿托伐他汀促进胆固醇逆向转运的机制以及ApoM在胆固醇逆向转运中的作用,为他汀类药物促进胆固醇逆向转运提供理论依据。第一部分 阿托伐他汀促进高脂血症小鼠胆固醇逆向转运的研究第一节ApoE基因缺陷小鼠高脂血症模型建立目的:采用C57BL/6小鼠和Apo E-/-小鼠,通过高脂饮食建立高脂血症模型,为进一步研究阿托伐他汀对高脂血症的治疗作用提供实验基础。方法:8周龄雄性C57BL/6小鼠和Apo E-/-小鼠,体重均为20-25g,分别用标准合成小鼠饲料或高脂饲料(主要含4%胆固醇,0.5%胆酸钠,10%猪油,0.2%丙基硫氧嘧啶)饲养8周,饲养环境为SPF级标准聚碳酸酯笼中,昼夜各12小时规律光照。实验分三组,对照组:C57BL/6小鼠+正常饲料,(n=4)。Apo E-/-小鼠普通饮食组:Apo E-/-小鼠+正常饲料,(n=4)。Apo E-/-小鼠高脂饮食组:ApoE-/-小鼠,高脂饲料,(n=4)。饲养8周后取血测定血清脂质。结果:各组小鼠初始体重无明显差异,饲养8周后,Apo E-/-小鼠普通饮食组及Apo E-/-小鼠高脂饮食组小鼠体重明显增加。Apo E-/-小鼠普通饮食组血清低密度脂蛋白(LDL),总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)与对照组相比明显升高(P<0.001),而Apo E-/-小鼠高脂饮食组小鼠血脂含量较普通饮食组小鼠升高更为显著(P<0.001)。结论:该方法建立的高脂血症小鼠模型,与人类过多摄入高蛋白高脂食物形成高脂血症的病理生理过程相似,为进一步研究阿托伐他汀促进胆固醇逆向转运提供了良好的实验基础。第二节阿托伐他汀在高脂血症小鼠的胆固醇逆向转运中的作用研究目的:使用阿托伐他汀治疗高脂血症,观察体内与胆固醇逆向转运相关的基因及蛋白表达水平,探讨阿托伐他汀在胆固醇逆向转运中的作用。方法:12周龄雄性C57BL/6小鼠以及第一节中建成的Apo E-/-小鼠高脂血症模型。分为四组,C57BL/6小鼠+普通饮食组,Apo E-/-小鼠+普通饮食组,高脂血症模型的Apo E-/-小鼠+生理盐水,高脂血症模型的Apo E-/-小鼠+阿托伐他汀,每组各5只小鼠。阿托伐他汀处理组每日定时灌胃,剂量为10mg/kg,连续灌胃2周。生理盐水处理组,每日定时生理盐水灌胃,剂量为0.1ml/kg,连续灌胃2周。C57BL/6小鼠和Apo E-/-小鼠+普通饮食组不做处理。各组动物处理结束后测定血清脂质,动物处死后取主动脉带斑块处标本,行油红O染色观察病理改变,RT-PCR和Western-blot检测肝脏标本的ABCA1,ABCG1,SCARB1和ApoM的表达变化。结果:阿托伐他汀组小鼠血清LDL较生理盐水组小鼠显著降低(P<0.01),而HDL及Preβ-HDL的水平显著增高(P<0.01)。阿托伐他汀组小鼠与生理盐水组小鼠血清中TC和TG的水平无明显统计学差异。阿托伐他汀组小鼠肝脏ABCA1和SCARB1基因和蛋白表达水平显著高于生理盐水组小鼠(P<0.01),高脂血症Apo E-/-小鼠肝脏apoM基因表达水平较C57BL/6小鼠和Apo E-/-小鼠+普通饮食组的低,但差异无显著性,而阿托伐他汀处理后aPoM表达水平显著高于生理盐水组(P<0.001)结论:阿托伐他汀干预Apo E-/-小鼠高脂血症模型后除了能够降低血清LDL,提高HDL外,还能够促进胆固醇逆向转运过程。第二部分阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响目的:探索阿托伐他汀促进胆固醇逆向转运的可能机制以及ApoM在胆固醇逆向转运中的作用。方法:1.首先建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,阿托伐他汀干预泡沫细胞,分为五组:对照组(正常生长的THP-1巨噬细胞),泡沫细胞组和阿托伐他汀三个不同浓度组(浓度分为0.1,1,1Oμmol/L)。干预后分别检测胆固醇逆向转运相关指标。2.阿托伐他汀干预HepG2细胞,分为对照组和阿托伐他汀三个不同浓度组(浓度分为0.1,1,10μmol/L),干预后检测ApoM mRNA和蛋白表达量变化。3.阿托伐他汀处理过的HepG2细胞上清液与THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞共培养,分四组:对照组(单纯泡沫细胞),泡沫细胞+HepG2上清(DMSO),泡沫细胞+阿托伐他汀,泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)。干预后分别检测胆固醇逆向转运相关指标。结果:1.建立的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型油红O染色下见大量红染脂滴存在于巨噬细胞胞浆中,与对照组相比,泡沫细胞的CD36和CD68 mRNA表达水平显著升高,泡沫细胞模型建立成功。2.阿托伐他汀处理泡沫细胞后SCARB1的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),而ABCA1,ABCG1和ApoM表达水平差异无统计学意义,细胞内TC,FC,CE含量变化无显著性差异(P>0.05),ELISA方法检测Pre-βHDL含量在五组间均无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,泡沫细胞组的胆固醇流出率显著增加(P<0.05),但是与泡沫细胞组相比,三个不同浓度的阿托伐他汀均未能显著提高胆固醇流出率。3.与对照组相比,阿托伐他汀能明显上调HepG2细胞中apoM mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。4.泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组ABCA1和SCARB1的mRNA和蛋白表达水平较泡沫细胞+阿托伐他汀组变化无显著性差异(P>0.05),但ABCG1表达水平明显上升(P<0.05)。泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组细胞内TC,CE含量明显降低(P<0.05),FC含量变化无显著性差异(P>0.05),Pre-β HDL含量在泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组较其他三组明显上升(P<0.05),胆固醇流出率亦显著增加(P<0.05)。油红O染色结果表明,阿托伐他汀单纯干预泡沫细胞后细胞内仍然大量脂质堆积,呈泡沫化改变,与未处理的泡沫细胞组无明显变化,而泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组可见细胞体积缩小,细胞内红染脂滴减少。结论:阿托伐他汀可以上调THP-1巨噬细胞源泡沫细胞中SCARB1的表达,但无法增加泡沫细胞内胆固醇的流出;阿托伐他汀可以增加HepG2细胞中ApoM基因和蛋白的表达;将阿托伐他汀处理HepG2细胞上清液与泡沫细胞共培养后ABCG1和Pre-β HDL含量上升,胆固醇逆向转运作用得到增强。第三部分 HepG2细胞高表达ApoM的基因芯片分析及TLR2在阿托伐他汀促进泡沫细胞胆固醇逆向转运过程中的作用第一节 HepG2细胞高表达ApoM的基因芯片分析目的:通过HepG2细胞高表达ApoM后行基因芯片表达谱分析ApoM的靶基因,筛选参与到胆固醇逆向转运过程中的相关基因。方法:采用Affymetrix基因芯片对ApoM慢病毒过表达组和对照组进行基因芯片表达谱分析,找出差异表达的基因,进行生物信息学分析。结果:通过差异表达的基因及其靶向功能的分析,我们选取了 Toll样受体2(TLR2),二酰基甘油脂肪酶α(DAGLA),ATP结合转运蛋白B4(ABCB4),Tribbles homolog 1(Trib1)以及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)五个可能的靶基因,其中TLR2和DAGLA在芯片中明显下调,ABCB4,Trib1和UGT1A1在芯片中明显上调。进一步通过RT-PCR方法证实了他们在阿托伐他汀干预了 HepG2细胞后发生了显著性改变。结论:TLR2,DAGLA,ABCB4,Trib1 和 UGT1A1 作为 ApoM 的靶基因,可能参与了 ApoM调控胆固醇逆向转运的过程。第二节 TLR2在阿托伐他汀促进泡沫细胞胆固醇逆向转运过程中的作用目的:在细胞水平验证阿托伐他汀通过ApoM及其靶基因TLR2信号通路途径参与了泡沫细胞胆固醇逆向转运过程。方法:通过TLR2激动剂Pam3CSK4上调TLR2的表达,观察其对阿托伐他汀介导的泡沫细胞胆固醇逆向转运过程的影响。实验分为对照组(单纯泡沫细胞),泡沫细胞+HepG2(DMSO)细胞上清,泡沫细胞+阿托伐他汀,泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀),泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)+Pam3CSK4。结果:加入TLR2激动剂Pam3CSK4后,泡沫细胞的ABCA1和SCARB1 mRNA表达水平较未加激动剂组差异无显著性(P>0.05),而ABCG1表达水平较泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)显著下调(P<0.05),蛋白水平的变化与基因水平一致。细胞内TC和CE含量明显上升(P<0.05),FC含量变化无显著性差异(P>0.05)。ELISA方法检测泡沫细胞Pre-β HDL含量在Pam3CSK4干预后与未干预组比较差异无显著性(P>0.05),泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组的胆固醇流出率显著增加(P<0.05),而TLR2激动剂Pam3CSK4干预后胆固醇流出率显著降低(P<0.05)。油红O染色结果表明,泡沫细胞+HepG2上清(阿托伐他汀)组的泡沫细胞体积较对照组和泡沫细胞+HepG2(DMSO)细胞上清组缩小,细胞内红染脂滴减少,加入TLR2激动机组细胞内红染增加,泡沫细胞明显增多。结论:TLR2在阿托伐他汀促进泡沫细胞胆固醇逆向转运的过程中起关键作用,作为ApoM的靶基因,受ApoM影响而下调,从而促进了 ABCG1的表达,使得胆固醇逆向转运得到加强。