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糖多孢红霉菌（Saccharopplysppra erythraea）是能形成气生菌丝的放线菌，产生的红霉素A在临床上有广泛的应用。目前，红霉素生物合成已经有较深入的研究，但是有关糖多孢红霉菌形态分化的报道还很少。TetR家族普遍存在于细菌中，主要参与多药抗性、抗生素的合成和形态分化等。实验室徐新强同学前期构建了SACE_0012基因敲除突变体△△SACE_0012，通过实验发现TetR调控子SACE_0012可能负调控糖多孢红霉菌中菌丝体的形成。本研究在此基础上进一步验证并探究SACE_0012影响糖多孢红霉菌形态分化的分子机制。
为了验证SACE_0012的功能，接种△SACE_0012到R3M平板上，置于30℃培养箱中恒温培养，观察突变株的形态分化情况，发现△SACE_0012孢子生长比出发菌株A226提前24h，但继续培养到第六天，△SACE_0012与A226表型无明显差异，说明SACE_0012负责糖多孢红霉菌早期菌丝体的形成。利用HPLC检测红霉素A的产量，发现△SACE_0012相比糖多孢红霉菌A226没有明显差异，说明SACE_0012不影响糖多孢红霉菌红霉素的合成。为了证明△SACE_0012形态分化提前是由于SACE_0012的作用，将SACE_0012克隆到大肠杆菌-糖多孢红霉菌整合性质粒pZMW中，构建出回复菌株△SACE_0012/pZMW_0012。结果回复菌株与A226生长一致，说明糖多孢红霉菌△SACE_0012形态分化提前是由SACE_0012的缺失引起的。通过敲除和回补实验证明，SACE_0012特异性地调控糖多孢红霉菌早期菌丝体的形成，不参与红霉素的合成。
为了探究SACE_0012对糖多孢红霉菌形态分化的分子机制，对△SACE_0012的形态分化基因whi、bldD、amfC和红霉素合成基因eryA转录水平进行定量分析。首先接种△SACE_0012和糖多孢红霉菌A226到R3M平板上，置于30℃培养箱中恒温培养4天，用液氮研磨法破碎菌体，提取糖多孢红霉菌A226和△SACE_0012的总RNA。然后取适量的RNA进行DNA的消化，最后取适量消化完全的RNA反转录成cDNA作为荧光定量PCR的模板。实时荧光定量PCR结果显示相比出发菌株A226，△SACE_0012突变株中红霉素合成基因eryA和全局调控子bldD的转录量无明显变化;SACE_2141， SACE_6464，SACE_6040（链霉菌中参与孢子形成的调控基因whiA、whiB、whiG的同源基因）的转录量也无显著变化;而SACE_7115（链霉菌菌丝体形成蛋白口amf的同源基因）的转录量是出发菌株的3倍，回复菌株△SACE_0012/pZMW_0012中SACE7115的转录量降低到出发菌株的水平。表明SACE_0012与红霉素合成无关，SACE_0012可能是通过AmfC途径影响糖多孢红霉菌早期菌丝体形成。
实验室徐新强前期构建了△bldD/△SACE_0012和△SACE_7040/△SACE_0012双突变体，发现缺失SACE_0012不能恢复△bldD的孢子生长，也不能加快△SACE_7040的孢子生长。为了深入研究SACE_0012与糖多孢红霉菌BldD和SACE_7040调控系统之间的关系，利用实时荧光定量PCR技术分析△bldD、△SACE_7040突变体中SACE_0012的转录量及△SACE_0012中bldD的转录量。结果显示，相比出发菌株A226，在△bldD和△SACE_7040突变体中SACE_0012的转录量有降低但无显著差异;在△SACE_0012中bldD的转录量也无显著差异。证实△SACE_0012突变株菌丝体形成提前是由于增加了amfC的转录，且SACE_0012是独立于BldD调控网络而参与糖多孢红霉菌早期菌丝体形成。
为了探讨SACE_0012和AmfC之间的关系，在糖多孢红霉菌A226中构建SACE_7115缺失突变株。构建方法如下:首先以糖多孢红霉菌A226基因组为模板，通过PCR方法扩增出SACE_7115两侧约1500bp的同源臂，并将SACE_0012的同源臂分别连接到质粒pUCTSR中硫链丝菌肽抗性基因tsr(thiostrepton resistance gene)的两侧，构建质粒pUCTSR△7115;然后以pUCTSR△7115为模板，PCR扩增片段，通过PEG介导的原生质体转化技术将大片段转入到糖多孢红霉菌A226原生质体中;在30μg/mL Thio的抗性条件下，筛选出有抗性的SACE_7115缺失突变体△SACE_7115。发现△SACE_7115形态分化相比A226延迟，这与△SACE_0012突变株的结果一致。更进一步证实SACE_0012是通过增加了SACE_7115的转录而作用于糖多孢红霉菌早期菌丝体形成。
综上所述，通过RT-PCR、基因敲除和回补分析，发现SACE_0012不影响糖多孢红霉菌的红霉素合成，独立于BldD调控系统，通过AmfC而调控糖多孢红霉菌早期菌丝体的形成。研究结论对全面理解糖多孢红霉菌形态分化调控机制具有重要意义。