帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中老年常见的神经系统变性疾病,其病理特征为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性缺失。谷氨酸兴奋性毒性在PD发病机制中的作用,一直是国内外研究的热点。正常条件下,谷氨酸被释放到突触间隙发挥作用后很快被位于星形胶质细胞和神经元胞膜上的兴奋性谷氨酸转运体所摄取。然而谷氨酸代谢的功能失调导致了 PD疾病的运动失调和认知缺损。突触间隙过多谷氨酸可以过度刺激突触后膜离子型和代谢型谷氨酸受体,进而介导兴奋性毒性作用。通过过度活化N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体,谷氨酸能诱导细胞内Ca2+超载,活性氧簇及活性氮根产生,进而导致线粒体功能障碍,并且因此导致神经元细胞死亡;通过过度激活α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,AMPA)受体和红藻氨酸(kainic acid,KA)受体,谷氨酸能诱导神经细胞的Na+内流和急性渗透膨胀并介导神经元死亡。兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)在摄取突触间隙谷氨酸中发挥重要作用,真核生物EAATs分为GLAST(谷氨酸/天门冬氨酸转运体,又称EAAT1),GLT-1(谷氨酸转运体-1,也称EAAT2),EAAC1(兴奋性氨基酸载体-1,又称EAAT3),EAAT4和EAAT5。在这五种亚型中,表达在星形胶质细胞上的GLT-1负责清除大约90%的谷氨酸。迄今为止,研究表明GLT-1表达降低与肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的发病机制密切相关。近几十年内,研究报道了P 模型中多种谷氨酸转运体的表达模式。在这些研究中,在由6-羟基多巴胺(6-hydroxydopam ine,6-OHDA),1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)和1-甲基-4-苯基吡陡(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)制备的PD模型中谷氨酸转运体功能障碍已被证明。然而,并没有直接证据表明谷氨酸功能障碍与PD的发病机制相关,直到Assous等在黑质和纹状体使用谷氨酸转运体抑制剂1-反式一吡咯烷-2,4-二羧酸酯(1-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate,PDC)成功模拟出一系列 PD 特征,包括神经元死亡和轴突营养障碍,以及当DA神经元丢失超过50%时产生的运动障碍。我们当前研究表明MPP+能够减少GLT-1在星形胶质细胞上的表达,这也部分表明了谷氨酸转运体水平与PD之间的关联。我们之前的研究发现头孢曲松钠可以改善MPP+处理的星形胶质细胞膜上GLT-1的表达,以及通过抑制核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)/JNK/c-Jun 信号通路。然而,谷氨酸转运体在 PD中的调控机制仍未被完全阐明。雷帕霉素是一种亲脂性大环内酯类抗生素,作为免疫抑制剂广泛用于临床。雷帕霉素通过抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)诱导自噬,因此阻断下游钙依赖性和非依赖性mTOR信号通路,以及在细胞内与FK506结合蛋白结合。研究表明雷帕霉素能够在一些列神经变性性疾病实验模型中发挥神经保护效应。此外,也有研究表明雷帕霉素可以减缓衰老以及延长寿命。以往的研究表明,雷帕霉素在PD中通过自噬清除错误折叠蛋白以发挥有效的神经保护作用,以及阻断RTP801/REDD1/Ddit4的翻译和残存激酶Akt的磷酸化以阻止DA神经元死亡。有研究报道雷帕霉素可以通过抑制鱼藤酮诱导的细胞死亡来保护DA神经元。此外,在DA神经元细胞模型中,雷帕霉素能够刺激PC12细胞轴突向外生长。研究表明,PINK1(家族性的PD-连锁基因)能够激活雷帕霉素靶蛋白复合物 2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2),诱导Akt磷酸化,进而发挥对体外SH-SY5Y细胞的神经保护作用。因此,雷帕霉素在治疗PD上是一种很有希望的药物,然而,它的作用机制目前还不清楚。先前的研究表明雷帕霉素治疗能够增加星形胶质细胞GLT-1的表达,并且PI3K/Akt/mTOR和mTOR/Akt/NF-KB通路参与了这种调节机制。然而目前仍然没有证据表明雷帕霉素是否可以在PD模型中调节谷氨酸转运体的表达以发挥治疗作用。目前,大量研究己经表明免疫反应在PD的发病机制中扮演着重要的作用,并且神经炎症成为了神经变性疾病治疗的新靶点。研究表明MTOR抑制剂RAD001能够促进免疫功能以及改善中老年人免疫衰老。然而,雷帕霉素是否能够在PD中调控免疫反应,以及相关的调控机制仍不清楚。在本文中,我们证实了雷帕霉素对于PD小鼠模型的神经保护性效应。首先,PD小鼠出现了明显的运动失调以及黑质和纹状体酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达明显减少。与MPTP处理组相比,雷帕霉素延长了 PD小鼠的悬挂时间以及缩短了它们的爬杆时间,表明雷帕霉素能改善PD小鼠模型的运动失调。雷帕霉素明显增加了 PD小鼠黑质和纹状体TH阳性神经元的数量。此外,雷帕霉素明显减少了 PD小鼠黑质α-突触核蛋白的聚集,TUNEL(the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)实验表明雷帕霉素可以明显减少PD小鼠黑质细胞死亡。因此我们得到雷帕霉素对于PD小鼠具有神经保护效应。在本研究中我们发现在MPP+处理的星形胶质细胞中,雷帕霉素治疗4个小时能够明显增加GLT-1总蛋白和膜蛋白的表达。雷帕霉素预处理能够明显增加MPP+处理星形胶质细胞对于谷氨酸的摄取,但对于GLAST的表达并没有明显的变化。在下面实验中,我们使用雷帕霉素处理细胞4小时。在体外实验中,雷帕霉素增加了 GLT-1的表达和功能。然后我们研究了雷帕霉素在PD小鼠体内对于谷氨酸转运体的作用。我们发现雷帕霉素可以增加PD小鼠黑质GLAST以及纹状体GLT-1在总蛋白水平上的表达。此外,雷帕霉素也可以增加PD小鼠黑质细胞膜上GLT-1和GLAST蛋白的表达,以及胞质中GLT-1蛋白的表达。免疫组化实验也表明雷帕霉素可以增加GLT-1的表达。与细胞膜上谷氨酸转运体表达增加相一致,雷帕霉素也增加了 PD小鼠黑质突触小体的谷氨酸摄取。这些结果表明雷帕霉素可以促进PD小鼠谷氨酸转运体的表达和功能。为了探索雷帕霉素诱导谷氨酸转运体上调的机制,我们检测了雷帕霉素治疗PD小鼠所涉及的调节谷氨酸转运体的相关信号通路。免疫荧光实验结果表明PD小鼠谷氨酸转运体与泛素之间的相互作用明显增加,表明PD小鼠中脑谷氨酸转运体被泛素化。我们发现雷帕霉素能够减少PD小鼠谷氨酸转运体泛素化。研究表明泛素连接酶E3 Nedd4-2介导谷氨酸转运体泛素化以及促进它们的降解。我们检测了雷帕霉素对于Nedd4-2所介导谷氨酸转运体泛素化的作用。我们发现雷帕霉素不能改变PD小鼠磷酸化的Nedd4-2的表达,磷酸化的Nedd4-2是一种活化状态的E3连接酶。然而,磷酸化的Nedd4-2在PD小鼠细胞胞质内表达明显增加,但雷帕霉素明显降低了胞质中磷酸化的Nedd4-2的表达,表明雷帕霉素可能抑制Nedd4-2将泛素提成给底物,进而抑制底物的降解。为了证实这一假设,我们采用免疫荧光实验检测了 Nedd4-2介导谷氨酸转运体的泛素化。p-Nedd4-2与谷氨酸转运体(GLT-1和GLAST)之间的相互作用在PD小鼠体内明显增加。雷帕霉素在PD小鼠体内能够降低p-Nedd4-2与GLT-1,GLAST之间的相互作用,表明雷帕霉素在PD小鼠模型中降低了 Nedd4-2介导的谷氨酸转运体的泛素化。我们的结果表明雷帕霉素在PD小鼠模型中降低Nedd4-2的活性,减少Nedd4-2介导的谷氨酸转运体的泛素化,因此增加了谷氨酸转运体的表达和功能。我们发现在MPP+处理24小时的星形胶质细胞上,雷帕霉素可以明显的增加IL-6的表达。再者,在MPP+处理24小时的星形胶质细胞中,雷帕霉素预处理可以激活JAK2/STAT3通路。我们ELISA实验结果也表明在雷帕霉素和MPP+处理的星形胶质细胞中,IL-6的分泌明显增加。因此,在下面的实验中,我们采用MPP+处理24小时的星形胶质细胞进行实验。小胶质细胞也是IL-6产生的主要来源并且小胶质细胞分泌的IL-6在PD的发病机制中可以导致炎症反应。我们检测了雷帕霉素对于MPP+处理的小胶质BV2细胞内IL-6/JAK2/STAT3通路的影响,并且小胶质BV2细胞是被广泛应用的小胶质细胞模型。我们发现雷帕霉素并没有改变MPP+处理的小胶质BV2细胞内IL-6的表达。此外,雷帕霉素能够在MPP+处理的小胶质BV2细胞内减少磷酸化JAK2和STAT3的表达。表明雷帕霉素在MPP+处理的小胶质BV2细胞内能够抑制JAK2/STAT3信号通路。与以往研究相一致,MPP+提高了IL-6的生成,并且我们ELISA实验结果表明在Rapa+ MPP+处理组和MPP++Rapa处理组IL-6的分泌明显减少。研究表明MPP+能够减少PC12细胞内IL-6 mRNA的表达以及MPP+能够部分通过改变IL-6的表达而导致PC12细胞的死亡。因此,我们检测了雷帕霉素在MPP+处理的PC12细胞内对于IL-6/JAK2/STAT3的作用。由于PC12细胞能够产生多巴胺并且表达有多巴胺转运体,因此它们广泛被作为多巴胺能细胞模型。在目前的工作中,我们发现IL-6蛋白在MPP+处理的PC12细胞内表达降低,然而,雷帕霉素对于IL-6的表达并没有明显的作用。再者,与对照组相比,MPP+处理的PC 12细胞内JAK2/STAT3通路的激活明显减少,并且雷帕霉素对于MPP+处理的PC12细胞内JAK2/STAT3通路的激活也没有明显的作用。这些结果表明雷帕霉素在于MPP+处理的PC12细胞内对于IL-6/JAK2/STAT3信号通路没有明显的作用。此外,雷帕霉素能够在MPP+处理的这三种细胞型中减少IL-6受体的表达。提示在体外的这些实验表明雷帕霉素能够促进星形胶质细胞分泌IL-6以及活化IL-6/JAK2/STAT3信号通路,此外,雷帕霉素能够抑制小胶质BV2细胞分泌IL-6并且抑制下游JAK2/STAT3通路的激活。我们进一步探究了这种现象是否存在于PD小鼠体内。首先检测了血清中IL-6的表达,并且我们发现与对照组和PD组相比,雷帕霉素可以明显促进血清中IL-6的表达。并且我们发现雷帕霉素能够增加PD小鼠中脑IL-6蛋白的表达。然而,雷帕霉素治疗对于PD小鼠中脑和纹状体内下游JAK2/STAT3通路并没有明显的改变。由于IL-6在体外星形胶质细胞内的表达增加,以及有研究表明IL-6能保护多巴胺神经元免受神经毒素损伤。所以我们通过荧光双染检测小鼠体内星形胶质细胞和神经元内IL-6的表达,并且我们发现与对照组和PD组相比,雷帕霉素治疗能够明显增加星形胶质细胞IL-6的表达。然而,IL-6在神经元内的表达均无明显变化。我们进一步研究调节IL-6分泌和表达的上流通路,并且我们也检测了 STAT3的效应分子。我们体外实验结果表明雷帕霉素治疗能够增加MPP+处理星形胶质细胞磷酸化Akt,和NF-κB的表达,我们体内实验结果表明雷帕霉素治疗能够增加MPP+处理星形胶质细胞磷酸化NF-κB的表达。雷帕霉素治疗也能够减少MPP+处理星形胶质细胞和PD小鼠中脑磷酸化S6的表达,S6是mTORC1的下流效应分子,这些表明在体内和体外实验中mTORC1是被抑制的。加入Akt,NF-κB(MK-2206,BAY11-7082)的抑制剂,我们发现在应用MK-2206后,rapamycin+MPP+,MPP++rapamycin和MPP+处理的星形胶质细胞IL-6的表达并没有明显的变化,此外,与rapamycin+MPP+组相比,MK-2206抑制了 MPP+处理星形胶质细胞MPP++rapamycin组IL-6的分泌。这些结果表明Akt部分调节了星形胶质细胞IL-6的分泌和表达。再者,我们发现使用BAY 11-7082后,rapamycin+MPP+,MPP++rapamycin 和 MPP+-treated 处理的星形胶质细胞的 IL-6表达和下流JAK2/STAT3通路并没有明显的变化。在MPP+处理的星形胶质细胞中,BAY 11-7082 明显降低了 rapamycin+MPP+ and MPP++rapamycin 组上清中IL-6的分泌。我们实验结果表明在MPP+处理的星形胶质细胞中,雷帕霉素通过mTOR/Akt/NF-κB通路调节星形胶质细胞IL-6的分泌和表达。与此同时,我们也检测了 STAT3下流的效应分子。由于我们发现雷帕霉素能够减少黑质中神经元的死亡,然后我们开始关注抗凋亡蛋白家族。在MPP+处理的星形胶质细胞和PD小鼠模型的体内以及体外实验中,我们发现雷帕霉素能够增加磷酸化bcl-xl的表达。然后我们使用NF-κB的抑制剂,BAY 11-7082,去处理这四组的星形胶质细胞,我们发现在rapamycin+MPP+,MPP++rapamycin,和MPP+处理组,磷酸化JAK2和STAT3的表达并没有明显变化。再者,使用BAY 11-7082和MK-2206后,这三组磷酸化bcl-2和bcl-xl也没有明显变化。因此我们的研究结果表明在MPP+处理的星形胶质细胞中,雷帕霉素主要是通过mTOR/Akt/NF-KB通路来调节星形胶质细胞IL-6的分泌和表达。此外,雷帕霉素可以激活IL-6/JAK2/STAT3通路来促进星形胶质细胞抗凋亡蛋白bcl-xl的表达。由于mTOR/Akt/NF-κB也可以调节谷氨酸转运体的表达,我们使用Akt和NF-κB的抑制剂检测这个通路是否也参与了谷氨酸转运体表达的调节。与MPP+组相比,Akt,MK-2206的抑制剂和NF-κB,BAY 11-7082的抑制剂能够减少rapmycin+MPP+组GLT-1膜蛋白和总蛋白的表达。MK-2206和BAY 11-7082也能够减少组rapmycin+MPP+组和MPP+组星形胶质细胞谷氨酸摄取活性。这些结果表明在MPP+处理的星形胶质细胞中,雷帕霉素通过mTOR/Akt/NF-KB通路部分参与调节谷氨酸转运体的表达和功能。综上所述,我们发现在MPP+处理的星形胶质细胞和MPTP制备的PD模型中,雷帕霉素治疗明显提高了谷氨酸转运体的表达和功能,并且这种调控机制部分与使用雷帕霉素降低胞质中泛素连接酶E3 Nedd4-2的活性相关。我们发现雷帕霉素能够减少Nedd4-2与谷氨酸转运体之间的相互作用,减少Nedd4-2介导的谷氨酸转运体泛素化水平,以及增加谷氨酸转运体的表达和功能。此外,雷帕霉素能够增加星形胶质细胞IL-6的表达,以及促进体内和体外星形胶质细胞衍生的IL-6的分泌。雷帕霉素能够通过星形胶质细胞自分泌途径激活IL-6/JAK2/STAT3通路。我们也发现通过活化JAK2/STAT3通路,雷帕霉素在PD模型中增加了抗凋亡蛋白bcl-xl的表达以及减少星形胶质细胞的死亡。再者,我们发现mTOR-Akt-NF-κB级联通路参与了谷氨酸转运体和IL-6的上调。并且雷帕霉素能够在PD模型体内和体外减弱免疫炎症反应,这可能是通过抑制小胶质细胞炎症细胞因子的产生来实现的。综上所述,我们的研究表明雷帕霉素可能成为一种治疗PD的有效药物,并且我们也发现了雷帕霉素在PD中的新型神经保护效应。