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目的研究三苯氧胺对乳腺癌细胞MCF-7生长及其放射敏感性的影响,探讨三苯氧胺对BTG1基因的调控作用,发现乳腺癌新的治疗靶点。方法选用人乳腺癌MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)细胞系作为研究对象。(1)采用CCK-8法检测三苯氧胺对乳腺癌细胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)的增殖的影响。(2)采用体外划痕愈合实验观察三苯氧胺对乳腺癌细胞迁移能力的影响,transwell小室侵袭试验观察三苯氧胺对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。(3)采用流式细胞术观察三苯氧胺对乳腺癌细胞周期的影响,磷脂酰丝氨酸外翻法(AnnexinⅤ和PI双染法)检测三苯氧胺对乳腺癌细胞凋亡的影响。采用JC-1检测试剂盒检测细胞线粒体跨膜电位。(4)采用活性氧(ROS)检测试剂盒、ATP含量检测试剂盒等,检测三苯氧胺对乳腺癌细胞中ROS和ATP能量代谢指标变化的影响。(5)采用Western blot法检测三苯氧胺对乳腺癌细胞中周期凋亡相关蛋白及BTG1蛋白表达的影响。(6)细胞克隆形成法检测三苯氧胺对乳腺癌细胞放射敏感性的影响。(7)采用细胞流式术检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞周期及细胞凋亡的影响。采用Western blot法检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞周期相关蛋白表达的影响。(8)采用单细胞凝胶电泳和γH2AX免疫荧光检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞照射后DNA损伤修复能力的影响。(9)采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞中(10)构建pcDNA-BTG1真核表达载体,应用脂质体转染到乳腺癌MCF-7细胞中,建立稳定转染BTG1MCF-7细胞株,采用RT-PCR和Western Blot法检测细胞克隆中BTG1的mRNA和蛋白表达水平,并对细胞的遗传稳定性进行鉴定。(11)荧光定量PCR检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞中BTG1的mRNA表达水平影响。(12) Western blot法检测三苯氧胺联合电离辐射对乳腺癌细胞BTG1蛋白表达的影响。结果(1)三苯氧胺可明显抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞的生长,且呈现显著的时间-剂量依赖关系。MDA-MB-435细胞24或48小时的IC50分别为:2.3μmol/L、1.7μmol/L,MCF-7细胞24小时的IC50为1.2μmol/L。(2)三苯氧胺作用后,乳腺癌MCF-7的侵袭能力同样受到了明显的抑制,且呈现剂量依赖关系。但三苯氧胺不能明显抑制MDA-MB-435细胞的体外侵袭能力。(3)三苯氧胺可引起乳腺癌MCF-7细胞G2/M期阻滞。(4)不同浓度三苯氧胺可诱导乳腺癌MCF-7细胞不同程度的凋亡,且与药物浓度具有良好的相关性。三苯氧胺作用后乳腺癌MCF-7细胞线粒体膜电位下降,启动线粒体凋亡途径。三苯氧胺可诱导乳腺癌MCF-7细胞中促凋亡蛋白Bax的表达增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,caspase-3蛋白的表达随着三苯氧胺浓度增加而降低。(5)三苯氧胺可诱导乳腺癌MCF-7细胞中ROS的爆发。ROS可抑制乳腺癌细胞生长作用,且这种抑制作用可被ROS清除剂所缓解。(6)三苯氧胺可诱导乳腺癌MCF-7细胞中BTG1表达随着三苯氧胺浓度增加而增高。(7)三苯氧胺对乳腺癌MCF-7细胞具有明显的放射增敏作用,增敏比为1.54。(8)三苯氧胺联合电离辐射,乳腺癌MCF-7细胞发生了显著的G2/M期阻滞,说明三苯氧胺与电离辐射对细胞周期阻滞具有一定的协同作用。三苯氧胺作用于照射后的乳腺癌ER阳性细胞可通过抑制cyclinB1、cyclinD1和CDC2,从而诱导G2/M期阻滞,而提高其放射敏感性。(9)三苯氧胺联合电离辐射,促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡,提高其放射敏感性。(10)加入三苯氧胺后,照射后乳腺癌MCF-7细胞中的γH2AX位点明显增多,意味着三苯氧胺可加重照射后的乳腺癌ER阳性细胞DNA损伤程度,且DNA损伤后修复能力也明显降低,从而提高其放射敏感性。(11)三苯氧胺联合电离辐射,促进乳腺癌MCF-7细胞ROS释放,提高其放射敏感性。(12)三苯氧胺联合电离辐射,调控乳腺癌MCF-7细胞BTG1表达,提高其放射敏感性。结论(1)三苯氧胺可有效地抑制乳腺癌ER阳性细胞的生长、转移及侵袭。(2)三苯氧胺可通过降低cyclin B1/cyclin D1的表达显著诱导乳腺癌ER阳性细胞G2/M期阻滞。(3)三苯氧胺可诱导乳腺癌ER阳性细胞内ROS爆发,并通过OXPHOS引起线粒体途径凋亡。(4)三苯氧胺可诱导乳腺癌细胞内ROS爆发,并通过OXPHOS引起线粒体途径凋亡。(5)三苯氧胺可增加乳腺癌ER阳性细胞的放射敏感性,其机制与细胞G2/M期阻滞相关;与ROS增加,促进细胞凋亡相关;与其抑制DNA损伤修复相关。(6)三苯氧胺联合电离辐射,可调控乳腺癌ER阳性细胞BTG1表达,参与细胞周期调控,实现G2/M期阻滞,抑制细胞生长,促进凋亡。(7)三苯氧胺联合电离辐射,可调控乳腺癌ER阳性细胞BTG1表达,参与DNA损伤修复,提高其放射敏感性。