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水泡性口炎(Vesicular Stomatitis,VS)是一种由弹状病毒科水泡病毒属的一些病毒引起的人畜共患传染病,感染马、牛、猪后主要表现为在舌背侧、齿龈、口唇、蹄冠状带、乳房及包皮等处皮肤出现大量的水疱和剥蚀性病灶。引起VS的VSV,为弹状病毒科,水泡病毒属病毒。到目前为止至少有28种水泡病毒可感染脊椎动物和无脊椎动物。而且,VS和FMD仅从临床表现上很难区分。VS感染人后表现为类流感症状。 根据已发表的序列,设计一对针对IN型水泡性口炎病毒(VSV)L蛋白基因序列的特异性引物。用IN型VSV通过腹部皮下、皮内接种人工感染5只乳鼠和脑内接种感染5只3周龄内ICR小鼠,在接种后2-5d内被接种小鼠全部死亡,采集死亡小鼠的脑、肝、脾、肾、淋巴结等组织,同时采集用于血清学试验小鼠的组织样品,另取未感染小鼠作为对照,将组织用研磨器研磨,用Trizol从组织样品中提取总RNA,进行RT-PCR扩增。运用该方法对人工感染的乳鼠、3周龄内ICR小鼠以及4-6周龄ICR小鼠各5个组织样品进行检测,结果人工感染的乳鼠、3周龄内ICR小鼠均为阳性,而人工感染的4-6周龄小鼠和对照小鼠均为阴性,同时运用该方法检测口蹄疫病毒、猪水泡病病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒,结果均为阴性,可见该方法在用于IN型水泡性口炎的诊断时具有高度的特异性和敏感性,从而为IN型水泡性口炎的防制工作提供了快速、准确、可靠的检测手段。 用幼仓鼠肾细胞(BHK-21)扩增IN型VSV,根据Genebank中发表的IN型VSV N蛋白基因的序列,设计合成一对引物,以VSV的总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增出约1.3kb的片段。将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-N,经EcoRI和HindⅢ限制性内切酶双酶切后回收目的DNA,用DNA连接酶将其连接到经EcoRI和HindⅢ限制性内切酶双酶切后的pET-32a表达载体。通过PCR、酶切及测序鉴定证实N蛋白基因以正确的阅读框架插入了pET-32a载体。将重组质粒转化大肠杆菌BL21株,并对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间以及诱导前菌液浓度进行优化,结果融合蛋白以包涵体的形式表