[背景]沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,C.t）是感染生殖道上皮细胞的专性细胞内寄生的病原体^[1]。全球每年估计有1.31亿新增的的沙眼衣原体感染患者^[2],虽然大多数病例自发消退,但感染持续存在可能会引起更严重的炎症。随着衣原体感染率逐渐攀升及耐药性的增加,迫切需要探索新的治疗方法。本课题组前期研究发现鼠肺炎沙眼衣原体质粒编码蛋白pgp5在导致女性输卵管病变中发挥重要作用。这一发现为研究衣原体的治疗方法提供了新的研究方向。[目的]体外获取鼠肺炎沙眼衣原体质粒编码蛋白pgp5基因及其纯化蛋白,制备兔源性多克隆抗体,从蛋白的表达水平、mRNA水平、溶解性等方面对蛋白的生物学特性进行分析。通过实验探索蛋白调控基因表达的分子机制。[方法]间接免疫荧光检测沙眼衣原体感染率,提取感染沙眼衣原体的HeLa细胞的总DNA,聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因,设计2组含酶切位点的引物使重组质粒中pET28a上的His标签分别位于pgp 5蛋白基因的上游和下游,分别将重组质粒pET28a/pgp5转化入大肠埃希菌DH5α中,提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再分别将重组质粒pET28a/pgp5转化入大肠埃希菌Rosetta（DE3）中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,镍柱纯化。用纯化复性后的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体滴度,Western印迹鉴定抗体特异性、间接免疫荧光检测抗体生物学活性。用Trizol法提取感染CM衣原体的总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR（qPCR）检测pgp5蛋白的RNA在不同时间点的表达情况。提取感染CM株衣原体的HeLa细胞的总蛋白,进行Western印迹实验检测pgp5不同时间点的表达情况。聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因TC0181,TC0319,TC0357,TC0419上游启动子区域基因片段。用胶回收试剂盒纯化后进行EMSA实验检测各基因与pgp5蛋白结合情况。[结果]沙眼衣原体感染率高达90%以上,保证后续实验的准确性。2组重组质粒所获得的pgp5基因片段经测序长度均为795bp,检索确认序列与Genebank一致。SDS-PAGE电泳显示重组质粒蛋白pgp5为沉淀蛋白。通过免疫家兔成功制备了多克隆抗体。ELISA检测多克隆抗体效价高达1:100000。Western印迹鉴定多克隆抗体具有良好的特异性,也证明沙眼衣原体内pgp5蛋白为可溶蛋白。细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与体外培养的沙眼衣原体特异性结合。qPCR结果显示衣原体生长发育周期中pgp5蛋白的RNA含量在早期高且随时间而减少,Western印记显示衣原体生长发育周期中的pgp5蛋白早期检测不出,在12h开始有表达并且随着时间的延长表达增多。EMSA实验结果显示pgp5蛋白不能与TC0181、TC0319、TC0357、TC0419上游启动子区域的特定DNA片段结合。[结论]成功构建了2组重组质粒pET28a/pgp5,成功表达、纯化复性了pgp5蛋白,成功制备具有高效价、强生物活性、高特异性的多克隆抗体,成功进行了pgp5蛋白的溶解性分析,发现在不同时间点pgp5蛋白的转录水平和表达水平,探索了pgp5蛋白与衣原体基因的可能的结合位点。为研究pgp5蛋白导致输卵管病变作用机制提供了重要的依据,能为诊断沙眼衣原体提供帮助,也能为衣原体疫苗的研究提供新的思路。