论文部分内容阅读
[目 的]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种重要的医院获得性感染革兰阴性条件致病菌。在全球范围内,随着抗菌药物的普及和不合理应用,致使多重耐药（Multidrug resistant,MDR）、广泛耐药（Extensively drug-resistant,XDR）菌的感染不断增加,导致临床感染后的治疗极度困难。目前,多黏菌素（Polymyxin）已成为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后选择。然而国内关于多黏菌素B耐药的临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的研究较少。本研究旨在探究多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株对多黏菌素B耐药的分子机制和基因组变异差异的情况,筛选出重要的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）突变位点,为进一步研究铜绿假单胞菌临床分离株对多黏菌素B的耐药机制奠定一定的基础,同时为临床抗菌药物的合理应用和新药物的作用靶点提供重要的科学依据。[方法]1.收集来自昆明医科大学第一附属医院、昆明医科大学第二附属医院和云南省第一人民医院医学检验科临床微生物室分离保存的116株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA）;用 VITEK-2 compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统和MS质谱仪对分离培养出的铜绿假单胞菌进行培养鉴定和药敏分析。采用微量肉汤稀释法（Broth microdilution method,BMD）测定多黏菌素B 的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）,筛选出多黏菌素B耐药（耐药组）的铜绿假单胞菌。依据耐药组菌株数量,充分考虑菌株的背景差异,选取对应数量的多黏菌素B敏感（敏感组）的铜绿假单胞菌。2.通过脂多糖提取、SDS-PAGE电泳及银染,对耐药组和敏感组细菌之间脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）生成量的差异进行比较。3.提取耐药组和敏感组铜绿假单胞菌的质粒,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增质粒介导的黏菌素耐药基因mcr（Mobile Colistin Resistance）,琼脂糖凝胶电泳进行检测。4.PCR扩增多黏菌素B耐药相关的主要突变基因,运用Sanger测序验证部分SNP位点,以探讨其可能的耐药机制。5.实时荧光定量 PCR（Quantitative Rea1-Time Polymeras Chain Reaction,qRT-PCR）实验比较耐药组和敏感组多黏菌素B耐药相关的基因表达的差异。6.提取耐药组和敏感组铜绿假单胞菌的DNA,并进行全基因组重测序,运用R语言、求交集、ANNOVAR软件等方法对测序数据进行处理分析。[结 果]1.116株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌中筛选出4株多黏菌素B耐药的铜绿假单胞菌。2.脂多糖提取、SDS-PAGE电泳及银染实验结果表明耐药组与敏感组细菌之间脂多糖的生成量没有差异。3.耐药组和敏感组中均未检测到mcr基因（mcr-1～mcr-8和mcr-10）。4.Sanger测序验证了全基因组重测序部分氨基酸变化结果,包括:（1）R1在PmrB上R390C和ParS上T387A的错义突变;（2）R2在PmrB上D70N和H340R的错义突变;（3）R3在ParR上I80L和V55I的错义突变;（4）R4在PhoP上P31Q的错义突变。（5）还发现耐药组细菌均有在ParS上H398R和PmrB上Y345H的错义突变;R1、R2和R3均有在PmrA上L71R的错义突变;R1在CprS上有H331Y、E386D、L411M的错义突变。5.所有pmrB突变的耐药株的pmrA的表达水平均高于参考菌株铜绿假单胞菌PAO1（P＜0.05）,所有phoQ无突变的耐药株的phoP的表达水平均高于参考菌株（P＜0.05）。此外,编码负责L-Ara4N生物合成和与脂质A结合的酶的arnA基因在所有研究菌株中的表达均显著上调（P＜0.05）,但编码负责L-Ara4N生物合成和与脂质A结合的酶的arnB基因仅在R2菌株中的表达显著上调（P＜0.05）。6.全基因组重测序结果（1）测序得到的数据与铜绿假单胞菌PAO1参考基因组进行比对,发现耐药组片段配对率均高于90%,敏感组片段配对率均高于80%;两组覆盖率均高于95%。（2）检测分析得到除S4菌株独有的SNP和InDel突变数量较多外,其余菌株独有的SNP和InDel突变数量相当。耐药组共有的独特SNPs位点有13个,分别位于 PA0404、PA1153、PA1232、PA1356、PA2069、PA2117、PA2118、PA2852、PA3340、PA3414和PA1945,其中在PA1945上共发生3个SNPs位点。耐药组无共有的独特InDel突变。但检测到多黏菌素耐药相关基因发生许多重要的氨基酸变化（如ParS的错义突变H398R等）。[结 论]1.碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌对多黏菌素B的耐药率在本研究中为3.45%。2.发现双组分调节系统中五个未报道过的氨基酸替换:PmrB的R390C、ParS的T387A、ParR的I80L和V55I、PhoP的P31Q;PmrB的突变可能是本研究中CRPA菌株对多黏菌素耐药的主要机制。3.基于全基因组测序和生物信息学分析,发现了 1 1个耐药组共有特征基因,其中PA1945可能与多黏菌素耐药相关。