在畜牧生产中,抓捕、采血、运输、断奶、分群、注射等操作程序均会引起家畜应激反应,在一定程度上影响生长和生产。本试验以家畜生产中常见抓捕或者限制活动过程中存在的束缚应激小鼠模型为研究对象,研究其对雄鼠生殖活动的影响,分析应激开始时期与雄鼠产生应激反应的关系,并从睾丸组织形态病理学、生殖细胞凋亡、睾酮合成、精子发生、氧化应激、内质网应激通路相关蛋白和线粒体凋亡信号通路等方面,阐明应激导致小鼠睾丸生殖细胞凋亡和生精功能障碍的机理。此外,还研究了4-苯基丁酸(PBA),Ghrelin(GHRL)和β-隐黄质(CRY)三种化学物质的抗应激效果及其作用机制。研究内容和结果如下:1束缚应激对初情期雄性小鼠生殖能力的影响目的:研究束缚应激对初情期雄性小鼠生殖功能的影响。结果:与对照组相比,应激组和恢复组的初情期小鼠体重、睾丸、附睾和精囊重量显著降低,精子畸形率显著升高,而睾丸、附睾和精囊相对重量均显著升高。应激显著降低血清中睾酮水平,而经过24h恢复后继续降低。应激显著提高生殖细胞凋亡率,恢复24h后并没有得到缓解。应激组和恢复组睾丸StAR基因和睾酮合成相关基因3β-HSD和P450scc的mRNA表达水平较对照组相比显著降低。结论:应激对初情期小鼠精子发生和睾酮合成产生明显的损伤作用,并且恢复24h并没有缓解这种损害作用;应激对初情期小鼠精子发生和睾酮合成的损害作用可能与睾丸StAR和睾酮合成酶基因表达降低以及生殖细胞凋亡有关。2应激对成年雄性小鼠生殖能力的影响及其分子机制目的:研究成年雄性小鼠经受束缚应激对睾丸功能和精子发生的影响。结果:与对照组相比,应激组和恢复组小鼠体重、睾丸和附睾重量显著降低,精子畸形率显著升高,而睾丸、附睾和精囊相对重量均显著升高。应激使小鼠睾丸发生明显病变,恢复24h后并没有得到缓解。应激组和恢复组小鼠睾酮合成酶相关基因StAR、3β-HSD和P450scc的mRNA表达水平较对照组相比显著下降。应激显著降低血清中睾酮水平,但恢复24h后显著高于应激组。应激组和恢复组睾丸生殖细胞内质网扩张,断裂呈现多数小空泡状,无规则排列于胞质,表明细胞发生了明显的内质网应激。线粒体超微结构发生显著的变化,应激组和恢复组小鼠生殖细胞的线粒体基质密度下降,嵴呈现不规则分布,多数线粒体出现残缺。应激显著上调线粒体中bax蛋白表达,下调cytc和bcl-2蛋白表水平,相反,应激显著上调胞质中cytc和bax蛋白表达水平。束缚应激显著上调ers相关应激蛋白xbp-1,p-jnk,chop,grp78和atf6的蛋白表达水平,而恢复24h后继续上调并显著高于应激组。结论:应激对成年小鼠精子发生和睾酮合成有明显的损害作用,并且恢复24h并没有缓解这种损害作用;应激对成年期小鼠精子发生和睾酮合成的损害作用可能与睾丸star和睾酮合成酶表达降低以及生殖细胞凋亡有关;应激诱导细胞色素c释放,激活胞质中caspase3凋亡信号通路;束缚应激诱导睾丸生殖细胞的凋亡可能是通过ers信号通路。3化学分子伴侣pba缓解束缚应激诱导的小鼠睾丸ers和生殖细胞凋亡目的:阐明ers介导的应激小鼠睾丸生殖细胞凋亡作用。结果:pba能够抑制内质网标记grp78和chop蛋白表达水平;pba还能够显著抑制xbp-1和jnk的磷酸化水平;另外,pba还能下调atf6蛋白表达水平。pba显著抑制束缚应激诱导的小鼠体重、睾丸和附睾重量的下降,能够抑制束缚应激诱导的睾丸和附睾相对重量的上升。pba能够缓解束缚应激引发的生殖细胞凋亡。pba抑制应激诱导的star、p450scc和3β-hsd基因mrna表达水平的上调。结论:pba能够部分抑制ers诱导的小鼠睾丸内质网应激和生殖细胞凋亡,同时抑制睾酮合成相关基因的表达下调。4ghrl抑制rs诱导的小鼠睾丸ers的效果及其机制目的:研究ghrl对rs诱导的小鼠睾丸ers的作用效果。结果:应激组的体重、睾丸和附睾重量均显著下降,而睾丸指数和附睾指数均显著上升,而ghrl组的体重、睾丸和附睾的重量显著高于应激组。应激组血清睾酮水平显著降低,而ghrl组显著高于应激组血清睾酮水平。应激组小鼠睾丸睾丸发生明显病变。而ghrl组睾丸组织基本正常,睾丸组织曲细精管各种细胞排列紧密,形态正常。应激组的睾丸生殖细胞凋亡数量显著增加,而ghrl组显著低于应激组。ghrl抑制应激导致的睾酮合成酶相关基因的mrna表达水平下调。可以显著抑制应激诱导的睾丸xbp-1,chop,grp78和atf6mrna蛋白表达水平;而ghrl处理后,应激诱导的xbp-1,p-jnk,chop,grp78和atf6mrna的表达显著被抑制。结论:ghrl能够显著抑制小鼠睾丸er相关蛋白的表达和生殖细胞凋亡。5β-隐黄质(cry)对小鼠睾丸支持细胞凋亡的影响及其机制研究目的:研究β-隐黄质对氧化应激介导的大鼠睾丸生殖细胞凋亡的效果。结果:cry可以缓解cd诱导的睾丸的组织形态学变化和生殖细胞凋亡;cry处理显著抑制cd诱导大鼠睾丸匀浆中t水平的降低;另外,cry处理抑制cd诱导睾丸脂质过氧化物(lpo)和丙二醛(mda)水平升高,部分缓解镉诱导的超氧化物歧化酶(sod),过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽(gsh)水平的降低。结论:cry可以缓解cd诱导的睾丸氧化应激损伤和生殖细胞凋亡。6β-隐黄质对小鼠支持细胞凋亡的影响及其机制研究目的:研究cry对lps诱导小鼠睾丸支持细胞炎症反应的作用效果及其机制。结果:cry显著抑制lps诱导细胞活力的下降和凋亡比例的升高。cry抑制lps诱导的炎性因子相关基因肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-10(il-10)、白细胞介素-6(il-6)和白细胞介素-1β(il-1β)表达上调;同时,cry还能抑制lps诱导的支持细胞生精相关基因(ar,hsf2,creb,fshr,inhβb和abp)表达的下调;另外,lps显著提高睾丸支持细胞p-erk,pp38,pp65蛋白表达水平(p<0.05),而cry处理显著抑制lps诱导的蛋白表达上调(p<0.05)。结论:cry缓解lps诱导的睾丸支持细胞炎症,mapk信号通路参与该反应过程,因此cry可能成为一种抗炎症的药物。综上所述,本研究发现:(1)应激对初情期和成年小鼠睾丸结构和功能有明显的损害作用,并且恢复24h并不能缓解这种损害作用;(2)应激对初情期和成年小鼠精子发生和睾酮合成的损害作用可能与睾丸star和睾酮合成酶表达降低以及生殖细胞凋亡有关;(3)ers信号通路和线粒体凋亡信号通路共同介导rs引发的小鼠睾丸生殖细胞的凋亡;(4)ghrl抑制束缚应激诱导的睾丸ers和生殖细胞凋亡;(5)pba能够部分抑制束缚应激诱导的ers介导的睾丸生殖细胞凋亡和睾酮合成酶相关基因的表达下调;(6)cry缓解提高cd诱导的大鼠睾丸组织氧化应激和生殖细胞凋亡;(7)cry抑制脂多糖引发的炎症反应,mapk参与cry抑制炎症反应过程。