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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的人畜共患病,在世界范围内导致巨大的经济损失,布鲁氏菌(Brucella)是该病病原,主要经过消化道、皮肤粘膜和呼吸道等途径侵入机体而发生感染和发病。布鲁氏菌主要寄生于网状淋巴组织,造成免疫系统病理进程,并常伴随有菌血症,对生殖、神经和骨骼系统造成严重损害。牛、羊等家畜是该病的主要传染源,接种疫苗是预防布鲁氏菌病的重要措施,但现有疫苗免疫后抗体持续存在,经典血清学诊断方法均不能有效区分疫苗免疫和自然感染,这对该病防治与净化是不利的,要从根本上清除该病必须研制新型疫苗,既能起到预防和切断布鲁氏菌的传播,又能将免疫与自然感染区分,标记疫苗是解决该问题一个很有前途的手段。马耳他布鲁氏菌疫苗株M5-90是在M5的基础上继续致弱获得,与M5相比对怀孕母羊更安全,其安全性和有效性等项指标均达世界先进水平。M5-90已被广泛应用于牛羊布鲁氏菌的疫苗防制,取得巨大成功,为我国人、畜布鲁氏菌病的有效控制作出重要贡献。Bp26蛋白为布鲁氏菌周质蛋白,具有较好的免疫活性,通常被用来作为血清学检测的靶蛋白,bp26基因的缺失突变不改变疫苗株的生物学特性和免疫保护原性。采用重组表达BP26蛋白为抗原建立的i-ELISA方法敏感性和特异性与布鲁氏菌s-LPS提取物为抗原的常规间接ELISA相近,bp26被认为是目前布鲁氏菌最为合适标记疫苗的靶基因之一。本研究以bp26基因作为重组靶位点,以疫苗株M5-90为亲本,通过同源重组将卡那霉素抗性基因(Kana~r)整合到M5-90布鲁氏菌基因组中,完全取代bp26基因的ORF,筛选双交叉重组阳性菌株。通过SDS-PAGE和Western blot检测,亲本菌株M5-90中迁移率约为29kd的BP26蛋白表达并可被鼠抗重组BP26蛋白的高免血清识别,而缺失株中该位置的反应结果为阴性;同时,bp26基因缺失菌株免疫小鼠制备的血清不能识别重组BP26蛋白,而亲本株M5-90免疫小鼠制备的血清与重组BP26蛋白反应为阳性。以上结果表明BP26蛋白在bp26基因缺失菌株中未表达,缺失株命名为M5-90-26。生物学特性鉴定证明,缺失株M5-90-26保持了光滑型特性,在形态学、生化特性、凝集特性和染料抑菌特性方面与亲本株M5-90保持了一致。从生长曲线看,生长和复制能力与亲本株M5-90差异不显著。小鼠康复时间试验结果表明,缺失株M5-90-26的残留毒力与亲本株M5-90相比,统计学分析二者差异不显著,康复时间约为13周,但在不同的时间段内毒力稍低。菌落分离曲线显示,二者在小鼠体内都以随时间递减的趋势从体内被清除,统计学显示二者差异不显著。而布鲁氏菌马耳他种的强毒株M28虽然也随时间递减,但15周内始终高出以上两种菌株约3.5Log10,差异显著,这也证明了M28强毒菌株特性和作为攻毒菌株的可行性。小鼠攻毒保护试验证明,M5-90和M5-90-26免疫45d和150d后,均引发机体产生了坚强的保护力,无论脾脏分离布鲁氏菌数还是脾脏重量,免疫组与PBS对照组差异都显著。免疫45d后,马耳他种强毒M28和流产种强毒544攻击结果表明,M5-90和M5-90-26免疫组比PBS对照组的菌落分离数低约2.48～2.97Log10/脾脏,脾脏重量与PBS对照组相差2.86～3.48倍,差异均显著。而M5-90-26与M5-90相比较,在以上两个方面差异均不显著,证明M5-90-26与M5-90在短期内诱导产生免疫保护力一致。免疫150d后M28攻毒保护试验表明,M5-90-26和M5-90同样产生了高水平的免疫保护力。M5-90-26和M5-90免疫组脾脏分离布鲁氏菌数与PBS对照组低约2.6～4.6Log10,同时脾脏重量免疫组与PBS对照组相差2倍,差异均显著,而免疫组之间差异不显著,证明M5-90-26同样保持了与M5-90一致的长期免疫保护能力。免疫持续期与短期免疫效力相比,缺失株M5-90-26保持了与亲本株M5-90相同的保护效力,二者均能维持在较高水平。小鼠体内s-LPS特异性抗体监测实验表明,缺失株M5-90-26可诱导与亲本株M5-90相似的体液免疫应答。以s-LPS为抗原的i-ELISA检测M5-90和M5-90-26免疫小鼠血清显示,特异抗体在免疫后第1周出现,第12周到达高峰,随后开始下降。统计分析表明二者差异不显著。免疫45d后攻毒,M5-90和M5-90-26产生了s-LPS抗体的记忆应答,抗体OD值呈明显上升趋势,并且二者之间差异不显著。实验表明缺失株M5-90-26与亲本株M5-90一样可以引发高水平的抗s-LPS体液免疫应答。以rBP26为抗原的i-ELSIA检测M5-90、M5-90-26和M28接种小鼠血清结果显示,M5-90和M28接种小鼠后体内BP26抗体在免疫后第1周出现,随后上升,到第4周时P/N比值均大于5,M28接种的BP26抗体一直维持在较高水平,而缺失株M5-90-26始终没有检测到BP26特异的抗体。免疫45d后攻毒,M5-90免疫组BP26抗体出现明显升高,而缺失株M5-90-26没有变化,表明没有抗BP26蛋白抗体被诱导出来。在小鼠体内证明可以利用i-ELISA将缺失株M5-90-26免疫血清与强毒M28感染小鼠血清区分开,为建立与标记疫苗配套的检测方法奠定理论与实践基础,证明了缺失株作为疫苗候选株应用的可行性。羊水平传播试验证明,免疫M5-90和M5-90-26的羊未感染同群混养的空白羊。免疫后1、3个月时通过RBT和s-LPS i-ELISA检测未发现空白羊的血清布鲁氏菌抗体转阳,证明二者没有水平传播能力。体外排菌检测试验表明,免疫M5-90和M5-90-26后未能在眼、鼻、口和生殖道等天然孔分离到疫苗菌株,证明肘关节内侧皮下免疫方式不会在以上天然孔排菌。体内组织布鲁氏菌分离试验表明,M5-90和M5-90-26在羊体内停留时间约为2个月,免疫后2.5个月和3个月后不能在淋巴结、肝、脾和肾分离到这两种疫苗菌株。毒力返强试验证明在羊体内3代盲传后毒力与传代前差异不显著,证明该缺失株毒力较稳定。以上结果表明,缺失株M5-90-26保持了与亲本株M5-90相似的安全性和复制水平。羊体内免疫原性试验证明,M5-90-26能够引发与M5-90同样水平的体液免疫应答。RBT检测证明M5-90-26与M5-90免疫后1周后98%～100%羊血清转阳,70～80d后开始下降,6个月之后下降到20%～30%,二者差异不显著。s-LPS i-ELISA证明二者诱导的抗体水平一致,细胞免疫检测表明M5-90-26与M5-90没有差异。证明M5-90-26与M5-90在羊体内的免疫原性保持了高度一致。综上所述,M5-90-26与亲本疫苗株M5-90相比,无论是安全性还是免疫原性都没有发生改变。其作为疫苗有着良好的应用前景,缺失株M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布鲁氏菌感染的能力,对布鲁氏菌病防制、监测及净化具有重要的意义。