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目的构建结核重组抗原ESAT-6、CFP-10及融合抗原rCFP10-ESAT6原核表达载体,经IPTG诱导表达,并在大肠埃希菌进行原核表达。获得纯化的蛋白产物,通过检测三者作为抗原刺激物在HIV感染者中的特异性T细胞反应,为建立艾滋病合并结核感染的诊断方法提供科学的实验依据。方法应用融合PCR(Fusion PCR)技术,从结核分枝杆菌基因组(HB37v)中成功克隆获得ESAT-6、CFP-10基因及rCFP10-ESAT6融合基因,连接到pGEM-T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白及融合蛋白;通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blotting免疫印迹分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)证实表达蛋白抗原特异性;并将三种纯化好的表达蛋白作为抗原,以健康者、确诊的活动性结核患者分别作为阴性对照、阳性对照,采用酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immuno-spot,Elispot)检测HIV感染者中特异性T细胞反应,通过患者外周血干扰素-γ分泌量的测定,判断其是否合并结核杆菌感染。结果本实验运用原核表达系统成功表达了结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10及rCFP10-ESAT6。pET-32a(+)-ESAT6以包涵体形式表达,重组蛋白分子量为31kD,表达蛋白约占菌体总蛋白的42%;pET-32a(+)-CFP10、pET-28a(+)-rCFP10-ESAT6以可溶性形式表达,重组蛋白分子量分别为33kD和28kD,表达蛋白分别占菌体总蛋白的73%、48%;经过确诊结核患者血清的Western blot、ELISA等方法检测均证实三者具有良好的抗原性。利用外周血单核细胞Elispot方法进行检测,结果显示斑点形成单位数(SFU/106 PBMC)在现症结核感染组和HIV合并结核感染组中显著升高,并与无合并结核感染的HIV组以及健康对照组间均存在显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。无合并结核感染临床表现的HIV组部分患者也可检测出有非常高的斑点形成单位数。结论利用大肠埃希菌BL21(DE3)成功表达、纯化了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10重组蛋白和rCFP10-ESAT6融合蛋白,并以三种蛋白分别作为抗原刺激物,利用Elispot方法对HIV合并结核感染进行检测,为早期无结核病临床表现的潜在结核感染者的发现提供了可能,同时为艾滋病合并结核感染诊断平台的建立提供了理论依据。