论文部分内容阅读
第一部分细胞外基质微环境提高干细胞抗氧化应激能力的研究目的:课题组前期研究开发出一种基于细胞自身分泌的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）生物材料,经过脱细胞处理并保留基质中特殊的组织结构和复杂蛋白成分,该生物材料可显著提高间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）在体外培养阶段的增殖能力;更为重要的是,MSCs胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平得到显著降低。本实验将研究细胞外基质生物材料是否具有抵抗氧化应激的能力,维持MSCs自我更新和定向分化的功能,并探讨细胞外基质生物材料抗氧化应激功能的分子机制。方法:首先制备细胞外基质生物材料,通过诱导骨髓细胞分泌细胞外基质,采用化学去污剂联合物理洗涤的方法脱细胞处理后得到结构完整的细胞外基质材料。采用扫描电子显微镜（SEM）和免疫荧光染色法（IF）分别检测细胞外基质生物材料的微观结构和蛋白成分。通过DNA定量法、细胞周期流式法检测干细胞增殖能力;DCF-DA荧光法、Red Hydrogen Peroxide Assay Kit（Invitrogen）试剂盒分别检测细胞内ROS和H2O2水平;相应试剂盒检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性;real-time PCR、Western blot检测相关基因和蛋白表达;最后诱导MSCs向成骨细胞分化,通过茜素红染色等检测MSCs定向分化能力。结果:SEM检测ECM生物材料中存在大量的胶原纤维,直径为320.6±49.5 nm;IF检测ECM生物材料中含有I型胶原（COL I）、III型胶原（COL III）、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LM）等多种蛋白成分。培养在ECM上的MSCs增值速度和处于S期的细胞比率明显高于普通培养板（tissue culture polystyrene plates,TCPS）,而G0/G1、G2期显著低于TCPS组。ECM组细胞内ROS和H2O2水平较TCPS组低41.7%、82.9%;ECM可在分子及蛋白水平提高SOD,尤其是SOD2的表达,ECM组SOD活性较TCPS组高70%;同时ECM提高细胞内CAT的表达,ECM组CAT的活性较TCPS组高40%以上。当诱导MSCs向成骨细胞分化时,经H2O2处理后TCPS组在钙基质沉积和成骨基因表达上显著弱于对照组,而ECM组基本上与对照组持平。进一步的信号通道研究揭示:ECM生物材料可能通过提高胞内SIRT1（哺乳动物沉默调节因子相关酶1）的表达,提高FoxO3等抗氧化基因的表达,由此提高MSCs的抗氧化应激能力及分化潜能。结论:体外构建的细胞外基质生物材料具有类似体内微环境的复杂微观结构和蛋白成分,MSCs在细胞外基质生物材料上培养时可有效抵抗氧化应激,保持MSCs自我更新和定向分化潜能。细胞外基质生物材料可作为一种新型的组织工程材料,结合干细胞技术应用于骨组织、软骨组织等缺损部位的修复,具备抵御缺损组织周围过度活性氧环境的性能。第二部分成骨诱导时自发上调的SIRT1提高间充质干细胞抗氧化应激能力的研究目的:研究氧化应激对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）成骨分化早期和晚期的影响,并明确SITR1在其中发挥的作用。方法:首先为确定H2O2对BM-MSCs生存率的影响,我们以梯度浓度（25到400μM）H2O2处理细胞,通过FDA染色、CCK-8法检测细胞生存率,流式细胞法检测细胞内H2O2含量。其次为明确H2O2对BM-MSCs成骨分化不同时期的影响,我们在成骨早期、晚期和全程加入H2O2（25μM,50μM,and 100μM）。最后为研究SIRT1在成骨分化早期、晚期中的作用,我们在成骨分化前7天加入5μM Res V（SIRT1特异性激动剂）,后7天加入10 m M NAM（SIRT1特异性抑制剂）。通过ALP染色、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色、RT-PCR的方法分析不同时期成骨分化水平。使用RT-PCR和Western blot分析成骨分化时细胞内SIRT1、抗氧化酶和成骨标志因子的表达变化。结果:H2O2浓度低于100u M时对BM-MSCs生存率无明显影响。细胞内H2O2含量与外源性H2O2浓度正相关。成骨分化全程加入H2O2时钙结节沉积受到抑制,成骨标志基因表达明显降低。成骨前期加入H2O2干细胞内碱性磷酸酶活性降低,成骨标志基因表达降低。成骨晚期加入H2O2,成骨分化不受明显影响。成骨分化时SIRT1、CAT、GPX1、SOD2基因和蛋白表达自发上调。成骨分化早期加入SIRT1激动剂可提高碱性磷酸酶活性,上调成骨标志基因表达,增加GPX1、SOD2和SIRT1蛋白表达。成骨分化晚期加入SIRT1抑制剂可抑制钙结节沉积,减少成骨标志基因表达,降低GPX1、SOD2和SIRT1蛋白表达。结论:氧化应激抑制BM-MSCs成骨分化,但成骨晚期干细胞的抗氧化应激能力有自发提高。BM-MSCs成骨分化时自发上调抗氧化应激能力是通过上调SIRT1表达来实现的。我们的结果预示了SIRT1在骨修复和干细胞再生中的具有潜在应用价值。第三部分细胞外基质微环境对破骨分化的影响及其机制的研究目的:以自提的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞为研究对象,探讨ECM是否可抑制单核细细胞向破骨细胞分化,并分析可能的作用机制。方法:首先,使用改良贴壁筛选法提取C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。以CD11b荧光抗体标记,流式细胞仪检测所提取细胞纯度。采用镜下观察和DNA定量的方法对比单核细胞在TCPS和ECM上的增殖能力。SEM观察单核细胞微形态。其次,为研究ECM对单核细胞破骨分化的影响,我们将原代单核细胞接种于TCPS和ECM,以20ug/L M-CSF和梯度浓度RANKL诱导分化。抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）和纤维肌动蛋白荧光染色鉴定单核细胞,RT-PCR检测破骨标志基因表达情况。最后,为明确ECM是否可通过降低单核细胞内ROS来抑制破骨分化,我们将原代单核细胞接种于TCPS和ECM,设定外源性H2O2亚组,以DCF-DA荧光法检测细胞内活性氧含量,TRAP染色和RT-PCR检测破骨分化水平。为明确ECM是否通过阻断NF-κB通路抑制破骨分化我们以免疫荧光染色追踪p65向核内转运情况,使用Western blot的方法检测NF-κB主要亚单位p65及其抑制体IκB的蛋白表达。为明确ECM的蛋白成分是否具有抑制破骨分化作用,我们以COLI和FN包被培养板并在其中诱导破骨分化。TRAP染色、纤维肌动蛋白荧光染色和RT-PCR检测破骨分化水平。结果:流式细胞结果显示所提取细胞CD11b表达率为96%。镜下观察接种7天后两组细胞密度达到90%,两组间细胞密度无明显差别。接种第第5天和第7天ECM组DNA含量高于TCPS组。扫描电镜下观察单核细胞呈圆形,核位于细胞中央,两组细胞形态无明显差异。TRAP染色结果显示随RANKL浓度增加,TCPS组破骨细胞数逐渐增加,细胞核大于3或8的多核细胞数明显高于ECM组。纤维肌动蛋白荧光染色结果显示,随RANKL浓度增加,TCPS组破骨细胞数逐渐增加,TCPS组肌动蛋白环面积和环内细胞核数明显高于ECM组。RT-PCR结果显示TCPS组破骨标志基因表达高于ECM组。DCF-DA荧光结果显示在RANKL存在的情况下,ECM使单核细胞内ROS含量降低36.8%,在加入20u M外源性H2O2后ECM组单核细胞内ROS水平与TCPS组无明显差异。TRAP染色结果显示ECM组加入H2O2后TRAP阳性细胞数高于未加H2O2亚组,细胞核大于3或8的多核细胞数也高于未加H2O2亚组。但是即使加入H2O2,ECM组TRAP阳性细胞数和多核细胞数仍低于TCPS组。RT-PCR结果也显示,加入加入H2O2后ECM组破骨标志基因表达有所上调,但仍低于TCPS组。免疫荧光染色结果显示加入50ng/L RANKL后TCPS组细胞质内p65大量转运至细胞核,而ECM组p65则仍留在细胞质中。Western blot结果显示ECM降低单核细胞p65和磷酸化IκB蛋白含量。以20u M H2O2对NF-κB通路进行干预后,免疫荧光染色结果显示ECM组有部分p65转运入细胞核,但转运量低于TCPS组。Western blot结果显示H2O2提高ECM组p65和磷酸化IκB蛋白含量。使用COLI和FN包被培养板并在其中诱导破骨分化发现,FN组和ECM组TRAP阳性细胞数较TCPS组明显降低,ECM组TRAP阳性细胞数低于FN组。FN和ECM抑制肌动蛋白环形成,FN组和ECM组肌动蛋白环面积分别是TCPS组的23.1%、3.1%。FN组和ECM组破骨标志基因表达量明显低于TCPS组,ECM组成骨标志基因表达相比FN组更低。结论:干细胞来源ECM通过降低细胞内ROS水平、阻断NF-κB通路、较高的纤连蛋白含量等多方面的协同作用降低单核细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶活性,减少细胞骨架纤维性肌动蛋白形成,抑制多核巨细胞融合,下调破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、OSCAR表达,抑制单核细胞的破骨分化。