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Dicer是一种在进化上高度保守的核糖核酸内切酶,属于RNase III家族的成员,可以特异识别并切割双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)。在大部分昆虫中,Dicer分为两个同源基因Dicer-1(Dcr-1)和Dicer-2(Dcr-2),二者分别作用在RNAi的miRNA途径和siRNA途径,同时Dcr-1可以参与生物体的生长发育调控。目前,小菜蛾上的Dicer还未有具体研究。因此,本实验利用CRISPR/Cas9技术分别敲除小菜蛾Dcr-1(PxDcr-1)和Dcr-2(PxDcr-2)基因,分析其对小菜蛾的影响,明确其功能。本实验通过PCR扩增拼接获得PxDcr-1和PxDcr-2两个基因,PxDcr-1的ORF为7524bp,编码2507个氨基酸,PxDcr-2的ORF为5085bp,编码1694个氨基酸,二者结构域基本相同,都含有解螺旋结构域、Dicer二聚体结构域、N端结构域、PAZ结构域以及两个RNaseⅢ结构域。但是PxDcr-2相比PxDcr-1缺少Dicer-PBD(partner-binding domain of the endo-ribonuclease Dicer)和dsRBD结构域(double-stranded RNA binding domain),这种结构上的差异可能导致二者功能上的不同。应用CRISPR/Cas9技术分别敲除PxDcr-1和PxDcr-2基因,获得基因敲除品系。PxDcr-1敲除获得两个突变品系,其中一个突变品系在PAM结构(NGG)后一个碱基处插入5个碱基的同时缺失一个碱基,表示为GGTAT-,另一个突变品系在PAM结构后缺失两个碱基,表示为--;PxDcr-2敲除同样获得两个突变品系,基因类型均表现在PAM结构后插入5个碱基,分别为AACGA和GATCC。这些突变品系从基因层面分析显示均可以使蛋白质翻译提前终止。与野生型小菜蛾相比,PxDcr-1敲除品系的小菜蛾不仅具有高死亡率、低羽化率、低产卵量、低孵化率等特征,而且卵巢相对细小,卵巢管干瘪,成熟卵量少;但PxDcr-2敲除品系小菜蛾具有正常的生长发育和繁殖能力。实验选取了Pxyellow和Pxwhite两个标靶基因,合成对应dsRNA后分别注射野生型品系和PxDcr-2敲除品系小菜蛾进行RNAi实验,结果显示野生型品系相应靶标基因表达量与对照组相比出现显著下降,成功实现RNAi现象;而PxDcr-2敲除品系各时期的靶标基因表达量与对照组相比均未出现显著差异,这说明敲除PxDcr-2后小菜蛾RNAi效果明显降低。本实验获得了PxDcr-1和PxDcr-2的敲除品系,这为以后的相关研究提供了实验材料,同时研究结果表明PxDcr-1参与调控了小菜蛾的生殖和发育,PxDcr-2则在RNAi通路中发挥着重要作用。