骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)最初是作为诱骨活性蛋白被发现，一经发现后立即成为研究热点，除BMP-1外，构成一个结构和功能相似的多肽因子家族，成为TGF-β超家族中最大的一个家族。目前研究发现：除BMP-1外，BMPs作为一类重要的形态发生素，不仅在胚胎时期骨组织分化发育和成年骨损伤修复中起着重要作用，还在胚胎发育的中胚层诱导和分化、造血组织的发育以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用，因而BMPs的研究不仅有重要的理论意义，还有着良好的临床应用前景。 BMP主要存在于骨组织中，但从骨组织中提取BMP方法很繁杂、获取量 第四军医大学硕士学位论文低＊6 八0ks湿骨入重复性差、难以得到足够量的BMP单一纯品。而临床上最好能够应用人的删P（hBMP），但人骨组织来源困难，限制了hBMP的应用及机理研究。 目前至少己有20个hBMP基因被克隆，分别称为hBMPI－15、CDMP－1、CDMP－2和hBMP－IB、3B和SB，人骨中含量最高的为hBMP－2、3、4、7，而诱骨活性最强的为BMPZ，4，7。hBMP编码的前体蛋白由N端的信号肽、中间的前肽和C端的成熟肽构成，需要经过糖基化修饰、折叠、切去信号肽和前肽等翻译后修饰才成为成熟的hBMPs。研究发现糖基化对hBMPS的生物学活性没有明显的影响，使得应用原核和低等真核表达系统表达制备hBMPS成为可能。 BMP《作为诱骨活性强＊ 床应用前景好的诱骨因子，己在COS及CHO等真核细胞表达系统、昆虫表达系统、原核表达系统中得到了成功表达，最终产物均具有较强的诱骨活性，但真核系统表达产量低。生产成本高：昆虫表达系统纯化困难；原核表达产物以包含体形式存在，需经过复性才能获得有生物学活性的产物，而复性效率往往极低，产物活性不稳定，重复性差。因此有必要进一步寻找一种生产成本低、操作简单、表达产物有良好的生物学活性的表达系统来产生有良好诱骨活性的重组hBMP士完整成熟肽，这将对hBMP－2的基础和临床研究有着重要意义。 酵母既是微生物、又是真核生物，这一特性决定了酵母在蛋白表达系统中的重要地位。与大肠杆菌相比，酵母的蛋白折叠系统更高级，在信号肽的帮助下，还可以将正确加工的重组蛋白分泌至培养基中，酵母还具有初级的糖基化能力，可对他r卜％V几r模体中的肪n进行糖基化：与哺乳动物细胞表达系统相比，酵母培养更简单，生长更迅速。 巴斯德毕赤酵母（Plchia pss tons）是近年来应用极为成功的一种 nm阴饲刚t砂Bb毗em心盯mla肌“出ularbiDbo刀bFom讪M加叮M印欣叨的伽M仰Xibe 第一页 第四军医大学硕士学位论文高效表达系统，遗传操作简单，表达水平高，糖基化形式更接近于高等真核生物；应用先进的高密度培养技术，毕赤酵母的密度可达500 OD。八，培养规模可放大至3000ms，目前己有许多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中得到了成功表达。因此，R p8s tonS是一种既适合实验室研究，又适合工业化生产的表达系统。 本研究的目的是利用PIChja psstoris．ThffeNuewar达人hBMP－2成熟肽，并对其表达产物进行纯化，研究该重组产物的生物学活性，为其应用打下基础。 本文首次利用酵母系统成功表达了BMP－Zm，并证明了表达产物具一定诱骨活性。首先以PCR技术获得编码人骨形成蛋白－2成熟肽的CDNA基因，将其同读框克隆到 Plchja psstorjs表达载体 pPICZ a B上的口因子的信号肽后边，线形化后电转入酵母宿主X－33，压力筛选出基因组中含有高拷贝数的外源基因的稳定整合子，经过基因组PCR鉴定和表型鉴定后，以甲醇诱导外源基因表达的方式进行重组子的表达鉴定，获得了稳定分泌表达 rhBMP－2。的酵母菌株 X－33－pPICZ a B－BMPZm。对该工程菌进行大量培养和诱导后，含有表达产物的上清用硫酸铰分级沉淀的方法进行粗分离，含rhBMP《 的沉淀溶解后经过疏水层析和阳离子交换层析两步液相色谱纯化，得到纯度约85％的rhBMP－Zm样品，所得样品经过充分透析后，分装并真空冷冻干燥。 得到的hBMP毛 样品用本室建立的以BMP家族信号转导下游转录因子 Cbfa的特异启动子控制 luciferase报告基因表达的 BMP测活系统进行细胞水平的生物学活性测定，10’～102gb水平即可使 luciferase报告基因表达显著升高；将冻干产物复合牛二型胶原植入小鼠肌袋内，测定其在动物整体水平的诱骨活性，试验证实获得的hBMP毛成熟肽具有一定 o仰们皿刎ofB仰山m山QmlamOWbiO仰出n卜FtMtwMwtUn卜0沈…Xibo 第s页 第四军医大学硕士学位论文的诱骨活性，植入后分别于7天、14天作组织石蜡包埋切片检查，7天时染色可见有大而圆的软骨细胞形成，I4天时可见少量小梁骨形成。显示所得到的hBMP－2成熟肽具有良好的生物学活性。