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一、研究背景与目的骨骼处于不断骨吸收和骨形成的平衡之中,而此平衡一旦打破就会导致骨代谢疾病的发生,如骨质疏松、骨关节炎等。破骨细胞是由单核巨噬细胞分化而来的巨大多核细胞。破骨细胞通过形成一个特殊吸收环结构,行使特有的骨吸收功能。研究破骨细胞增殖、分化与功能的调节机制对于阐明骨代谢疾病的发病机理、寻找其有效药物防治靶点,具有重要意义。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。mTOR信号通路是机体感受营养与各种应激信号,调控细胞生长、增殖与代谢的关键信号通路[1]。mTOR通过与细胞其他蛋白相互作用形成两种不同的复合物行使功能,包括mTOR复合物1和2(mTORC1与mTORC2)。其中mTORC2的特有组成蛋白为Rictor。mTORC2可以通过下游底物如Akt,调控肌动蛋白细胞骨架重组、细胞存活与细胞分化,也可以促进成骨细胞粘附与存活从而影响骨代谢。但Rictor/mTORC2在破骨细胞增殖、分化与功能调节中的作用与机制目前尚未见研究。本课题通过破骨细胞特异敲除Rictor的小鼠与细胞,发现Rictor/mTORC2在破骨细胞增殖与分化中起重要作用,为骨代谢调节的机制研究提供了新观点。二、研究方法构建破骨细胞特异性敲除Rictor的小鼠模型,并通过基因型鉴定,免疫组化、免疫荧光及免疫印迹等蛋白水平验证确认小鼠破骨细胞Rictor缺失。通过检测小鼠生长发育情况;microCT测量骨密度、组织学实验切片染色显微镜下直接观察计数统计等方法确认破骨细胞敲除Rictor之后对小鼠骨量以及破骨细胞数量的影响。通过酶联免疫吸附试验及钙黄绿素实验检测成骨细胞功能。通过透射电子显微镜观察破骨细胞敲除Rictor之后超微结构尤其是吸收环结构的变化。原代破骨细胞分化实验检测验证体内实验结果。通过低钙饮食模型检测破骨细胞Rictor敲除后对破骨细胞动员与骨丢失的影响。三、研究结果1.破骨细胞分化过程中Rictor表达上调;2.成功构建破骨细胞特异性敲除Rictor的转基因小鼠;3.破骨细胞特异性敲除Rictor对小鼠生长发育无明显影响;4.microCT分析表明20周龄RictorKO小鼠比同窝对照小鼠骨密度增加;5.HE染色分析表明破骨细胞RictorKO小鼠骨小梁增多;6.破骨细胞Rictor敲除后对小鼠成骨细胞数量及骨形成作用无明显影响,但可抑制骨吸收作用;7.透射电子显微镜分析表明特异性敲除Rictor之后破骨细胞形态结构未受影响;Trap染色和破骨细胞计数发现RictorKO小鼠破骨细胞数量明显下降;8.体外实验证明特异性敲除Rictor的破骨细胞分化及骨吸收能力下降;9.6周龄与20周龄RictorKO小鼠低钙1或4周破骨细胞数量上升较对照组少,骨量丢失也显著减少,表明Rictor敲除对低钙引起的破骨细胞动员与骨丢失有抵抗作用。四、结论1.破骨细胞Rictor/mTORC2对小鼠骨骼生长发育不是必需的。2.破骨细胞特异性敲除Rictor的小鼠破骨细胞数量减少,骨吸收能力下降,但骨形成能力不受影响,最终导致骨量渐进性增加。3.Rictor/mTORC2在破骨细胞前体的增殖与分化中起重要作用。4.敲除Rictor/mTORC2可抵抗低钙引起的破骨细胞动员与骨丢失,靶向Rictor/mTORC2可以作为防治骨丢失相关疾病的新策略。