论文部分内容阅读
褐飞虱Brown planthopper（BPH）,Nilaparvata lugens（St（?）l）是具有严重破坏性的单食性水稻害虫,其防治是害虫治理中的难题。微生物群落结构在昆虫内环境系统中有非常重要的影响,是反映昆虫内环境不可缺少的内容。翅二型是昆虫平衡飞行能力和繁殖能力之间的计策。为阐明不同翅型褐飞虱体内共生菌的多样性,本论文以不同翅型的雌性褐飞虱为研究对象研究了不同翅型褐飞虱在不同发育时间共生菌数量的变化,基于16S r RNA和ITS序列构建宏基因组文库,比较分析不同翅型褐飞虱肠道和脂肪体内共生菌种类多样性和群落结构。具体研究结果如下:1、通过荧光定量PCR研究不同翅型不同发育阶段褐飞虱共生菌数量发现,不同翅型肠道共生细菌数量在羽化第1天到第4天单位肠道共生细菌数量的变化趋势是先减少后上升,长翅褐飞虱单位肠道共生细菌数量在羽化第1天和第2天显著大于短翅褐飞虱,在羽化第4天单位肠道共生细菌数量无显著性差异。在羽化第1天到第4天不同翅型单位脂肪体共生细菌数量的变化规律均是逐渐增加,短翅褐飞虱单位脂肪体共生菌数量在羽化第1天和第2天显著大于长翅褐飞虱,羽化第4天单位脂肪体共生细菌数量无显著性差异。在羽化第1、2、4天,不同翅型肠道单位肠道中共生真菌数量逐渐增加,单位脂肪体共生真菌的数量先增加后减少。羽化第2天和羽化第4天的短翅褐飞虱单位肠道及脂肪体共生真菌的数量均显著大于长翅褐飞虱。2、基于16S r RNA序列构建宏基因组文库,对不同翅型褐飞虱肠道及脂肪体共生细菌进行高通量测序。在相似度为97%的水平下对每个样本优化的序列进行OTU聚类,长（短）翅褐飞虱肠道细菌共得到OTU数345（293）个,共发现细菌15（16）门、30（32）纲、78（75）目、137（115）科、245（184）属;长（短）翅褐飞虱脂肪体细菌共得到OTU数150（183）个,共发现细菌13（11）门、20（18）纲、43（48）目、71（77）科、111（121）属;两种翅型肠道和脂肪体的优势菌门均为变形菌门Proteobacteria,长翅褐飞虱和短翅褐飞虱肠道及脂肪体的优势菌属分别为沙雷氏菌属Serratia和不动杆菌属Acinetobacter。根据Alpha多样性的Ace指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数分析,短翅褐飞虱肠道细菌物种丰富度高于长翅褐飞虱肠道细菌,长翅褐飞虱肠道细菌物种多样性显著高于短翅褐飞虱肠道细菌,短翅褐飞虱脂肪体细菌物种丰富度和多样性均高于长翅褐飞虱脂肪体细菌。根据COG功能分析,长翅褐飞虱和短翅褐飞虱肠道及脂肪体细菌主要参与的代谢途径是氨基酸运输和代谢,且短翅褐飞虱细菌相对丰度高于长翅褐飞虱细菌,另外细胞外结构在长翅褐飞虱细菌丰度高于短翅褐飞虱细菌。研究结果初步说明长短翅褐飞虱肠道和脂肪体共生细菌多样性和菌落组成存在差异。3、基于ITS序列构建宏基因组文库,对不同翅型褐飞虱肠道及脂肪体共生真菌进行高通量测序。在相似度为97%的水平下对每个样本优化的序列进行OTU聚类,长（短）翅褐飞虱肠道真菌共得到OTU数63（165）个,共发现真菌5（9）门、13（26）纲、17（42）目、25（62）科、30（73）属;长翅褐飞虱脂肪体真菌共得到OTU数60（57）个,共发现真菌4（5）门、13（15）纲、16（17）目、23（24）科、28（29）属。两种翅型肠道和脂肪体的优势菌门均为子囊菌门Ascomycota,两种翅型肠道和脂肪体的优势菌属均为未注释属肉坐菌目unclassified＿Hypocreales。根据Alpha多样性的Ace指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数分析,短翅褐飞虱肠道真菌物种丰富度和多样性高于长翅褐飞虱肠道细真菌;长翅褐飞虱脂肪体真菌物种丰富度和多样性高于短翅褐飞虱脂肪体真菌。根据FUNGuild功能分析,不同翅型褐飞虱肠道和脂肪体真菌中主要营养类型均是腐生营养型（Saprotroph）,主要功能类群均是未定义腐生真菌（Undefined Saprotroph）且长翅褐飞虱相对丰度高于短翅褐飞虱。研究结果初步说明长短翅褐飞虱肠道和脂肪体共生细菌多样性和菌落组成存在差异。本研究为进一步研究褐飞虱共生菌对宿主的调控提供理论依据。4、结合荧光定量PCR和高通量测序两种方法的结果统计和分析不同翅型褐飞虱优势共生菌属的数量差异。沙雷氏菌属Serratia、布鲁氏菌属Brucella、寡养单胞菌属Stenotrophomonas在长翅褐飞虱肠道和脂肪体中的绝对数量均远大于短翅褐飞虱;微杆菌属Microbacterium、葡萄球菌属Staphylococcus、不动杆菌属Acinetobacter在短翅褐飞虱肠道和脂肪体中的绝对数量大于长翅褐飞虱;鞘脂单胞菌属Sphingommonas、鞘胺醇杆菌属Sphingobacterium、氏菌属Bosea在长翅褐飞虱肠道中的绝对数量均远大于短翅褐飞虱,脂肪体反之。篮状菌属Talaromyces、假丝酵母属Candida在长翅褐飞虱肠道和脂肪体的绝对数量均远大于短翅褐飞虱;未注释属肉坐菌目unclassified＿Hypocreales、皮状新丝孢酵母属Cutaneotrichosporon和未注释属真菌类群unclassified＿Fungi在短翅褐飞虱肠道和脂肪体中的绝对数量均大于长翅褐飞虱;镰刀菌属Fusarium仅在长翅褐飞虱肠道的绝对数量远大于短翅褐飞虱。本研究丰富了褐飞虱共生菌的内涵,为后续褐飞虱-共生菌互作以及共生菌在宿主中的功能研究奠定理论基础。