研究目的随着对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)病理机制研究的不断深入,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路在细胞凋亡过程中的重要作用受到越来越多的关注,逐渐地成为研究热点之一。本研究采用双侧颈总动脉夹闭术(Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAo/2-VO)制作小鼠脑缺血再灌注模型,从JNK信号转导线粒体通路的不同环节--CIRI模型、CIRI特征、JNK活化、Bcl-2与Bax平衡、AIF释放、细胞凋亡结果的多个层次,探讨电针百会穴、膈俞穴、肾俞穴对脑CIRI损伤引发的JNK非转录依赖方式诱导神经细胞凋亡的调控作用。研究方法SPF级成年雄性C57BL/6小鼠78只,采用随机数字表法分为3组(每组26只):假手术组、模型组、电针组。模型组和电针组小鼠制作BCCAo/2-VO模型,假手术组只分离双侧颈总动脉,不阻断血流,尾尖不放血。电针组小鼠造模成功后给予百会穴、膈俞穴、肾俞穴电针干预。“百会穴”,“膈俞穴”和“肾俞穴”分布在动物的头部和背部,百会穴为平刺,针刺深度为5mm,而膈俞穴、肾俞穴垂直针刺深度为3 mmm。采用连续波,频率3次/秒。强度以针柄颤动,但能使动物保持安静、不挣扎嘶叫为度,电针刺激时长为10min,于造模成功2h后进行。假手术组和模型组小鼠不进行干预,只接受与电子组动物一样的抓取束缚刺激。造模成功,小鼠于清醒后2h、24h,采用神经功能缺失体征5分评分法及卒中指数评分法评价各组小鼠的神经功能。动物核磁检测各组小鼠MRI、MRA,HE染色检测各组小鼠脑组织形态学的变化,运用TUNEL检测以确定各组小鼠神经细胞的凋亡情况。流式细胞术(Flow Cytometry/financal capacity model,FCM)对各组小鼠的神经细胞凋亡情况进行定量检测,并检测各组小鼠脑组织中JNK的激活状态。免疫组化技术检测各组小鼠脑组织中NSE、AIF的表达。以及运用免疫印迹法(Western Blot,WB)检测小鼠皮层、海马组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达。研究结果1.电针对脑缺血再灌注小鼠神经功能评分的影响造模2小时后采用“5分法”与“卒中指数评分”法评价,模型组评分明显高于假手术组(P<0.05),电针组与模型组评分没有明显区别(P>0.05);造模24小时后采用“5分法”与“卒中指数评分”法评价,模型组评分明显高于假手术组(P<0.05),电针组评分明显低于模型组(P<0.05)。由此可知,电针干预24小时后可明显改善脑缺血再灌注小鼠的神经功能评分。2.电针对脑缺血再灌注小鼠颅脑核磁影像及脑组织形态的影响假手术组MRI未见明显梗死灶及水肿,假手术组MRA血管清晰,未见明显走行异常;模型组MRI水肿现象明显(白色高亮区),水肿体积52.8mm3,模型组MRA血管走行模糊,可见明显狭窄和中断。通过HE染色观察各组海马CA1区的病理变化,假手术组海马锥体细胞排列整齐,细胞形态正常,光染色清晰,核仁清晰,具有完整的框架结构。然而,模型组海马CA1区细胞排列紊乱、稀疏,可见神经细胞的缺失和变形,核固缩,核仁深染。电针组的形态变化与模型组类似,但较模型组细胞排列更规则,核仁较清晰。此外,水肿、神经细胞缺失和变形减轻。3.电针对小鼠神经细胞凋亡、JNK激活的影响模型组的海马、皮层细胞凋亡值明显高于假手术组(P<0.05),电针组的海马、皮层细胞凋亡值明显低于模型组(P<0.05)。小鼠海马、皮层JNK激活状态荧光强度可知,各组小鼠皮层组织JNK激活状态荧光强度之间没有明显差别(P>0.05)。但是,电针组海马组织JNK激活状态荧光强度低于模型组(P<0.05)。4.电针对小鼠海马、皮层NSE、AIF表达的影响模型组海马CA1区、皮层区域与假手术组小鼠比较,NSE阳性神经元数量明显增多(P<0.05);电针组与模型组相较,海马CA1区与皮层区域NSE阳性细胞明显减少(P<0.05)。假手术组海马与皮层组织未见明显AIF阳性细胞;海马CA1区与皮层均存在大量AIF阳性细胞,模型组与假手术组相比较,AIF阳性细胞数明显增多(P<0.05);电针组与模型组相比较,海马CA1区与皮层AIF阳性细胞明显减少(P<0.05)5.电针对JNK信号通路中相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表达的影响电针组海马和皮层Bax、Caspase-3的灰度值明显低于模型组(P<0.05),电针组海马、皮层Bcl-2灰度值明显高于模型组(P<0.05);然而,电针组Caspase-9的灰度值与模型组没有明显区别(P>0.05)。结论1.电针干预能够有效改善脑缺血再灌注小鼠神经功能缺失5分评分法和卒中指数评分法的评分。2.电针干预可以减轻小鼠皮层、海马神经细胞缺失、固缩和异常变形,减少神经细胞的凋亡。3.电针干预可以抑制CIRI小鼠海马细胞JNK的活化,上调CIRI小鼠海马、皮层组织Bcl-2表达,下调Bax表达,并能够抑制CIRI小鼠海马、皮层组织Caspase-3的表达和神经细胞NSE和AIF的表达。