第一部分:低氧下Cdc6调控E7表达细胞越过G1期阻滞的研究研究目的:人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染是全球最常见的性传播疾病之一。高危型HPV是导致宫颈癌发生的首要启动因子。尽管目前HPV预防性疫苗已经上市,但对于已经感染或患有免疫抑制病的病人无效。高危型HPV的致病机制尚未完全阐明,因此深入理解HPV的致病机制仍然是有效防治宫颈癌及其它相关癌症的重要前提。HPV-16是感染率最高的高危HPV型别,在多数宫颈癌患者中表达。HPV的恶性转化功能主要依赖于其早期蛋白E6和E7,E6和E7分别通过降解p53和pRb抑癌蛋白导致细胞周期紊乱,细胞异常增殖。此外,E7的表达还能引起宿主细胞DNA损伤及基因组不稳定。研究证实HPV-16 E7的持续性表达对于宫颈癌前病变及宫颈癌的形成及发展均至关重要。低氧是恶性实体肿瘤微环境的特征之一。细胞增殖加速导致肿瘤内部氧气缺乏使肿瘤细胞一直处于低氧压力之下,同时导致低氧诱导因子1α （Hypoxia-induciblefactor1-alpha,HIF-1α）的失调和过表达。作为重要的转录因子,HIF-1α 一方面调控血管内皮生长因子,促红细胞生成素,以及代谢关键酶等帮助肿瘤细胞在低氧压力下生存;另一方面,HIF-1α又能抑制肿瘤细胞增殖。HIF-1α可通过上调p53及p27使细胞停留在G1期。最新研究表明,HIF-1α可与细胞分裂周期蛋白6 （Cell division cycle 6,Cdc6）结合,调控Cdc6和微小染色体维持复合物（Minichromosome maintenance protein complex,MCM）的形成及MCM的活性,阻止DNA复制,诱导细胞周期阻滞。在HPV阳性宫颈癌中,由于癌基因E6、E7的存在使得细胞的低氧应答及增殖调控变得更加复杂。因此,探究低氧状态下HPV阳性宫颈癌细胞的增殖特点及调控机制非常重要。细胞分裂周期蛋白6 （Cdc6）在真核生物DNA复制中起到重要作用,其经典功能是在细胞周期G1期参与前复制复合体（Pre-replication complex,preRCs）的组装,起始DNA复制,使细胞进入S期。当Cdc6高表达时,细胞又能表现出癌细胞特征,因此,Cdc6被普遍认为与肿瘤恶性转化有关。在宫颈组织中,Cdc6在CIN Ⅲ及宫颈癌中高表达,宫颈涂片的Cdc6免疫组化结果可作为诊断细胞恶变的标记物。近年有文献报道Cdc6在细胞周期G1/S期转换中发挥作用。Cdc6通过释放与p21,p27结合的细胞周期蛋白依赖性激酶2 （Cyclin dependent kinase 2, Cdk2）来推动细胞周期进程。我们近期的研究发现,Cdc6的表达水平在HPV-16 E7表达细胞中显著上调;在血清饥饿等条件下Cdc6在E7细胞逃避G1检验点过程中发挥作用。这些研究结果提示,Cdc6参与了 E7蛋白诱导的宿主细胞周期紊乱。但在低氧状态下,Cdc6在宫颈癌发生过程中的作用及调控机制尚未见报道。综上,本研究提出以下研究目标:（1）探究低氧下HPV-16 E7表达细胞及宫颈癌细胞的增殖水平变化;（2）探究低氧下Cdc6调控HPV-16 E7细胞越过G1期阻滞的作用及机制。以上研究将有助于阐明HPV致癌新机制,为发现宫颈癌治疗新靶点提供实验依据。研究方法:1. HPV-16 E7表达细胞在低氧条件下增殖水平的检测1.1低氧模型的构建:采用三种方法对RPE1 vector和RPE1 E7细胞进行低氧处理,分别是1)将细胞置于1% O2浓度低氧培养箱8小时;2)采用不同浓度去铁铵（DFO）模拟低氧;3)采用不同浓度氯化钴（CoCl2）模拟低氧（但实验过程中发现其对DNA有损伤后弃用）。1.2 HPV-16 E7表达细胞在低氧条件下细胞活力检测:用不同浓度DFO或CoCl2对RPE1 vector和E7细胞进行处理,培养72h后使用细胞增殖检测试剂盒（Cell counting kit 8,CCK8）检测细胞活力水平。1.3 HPV-16 E7表达细胞在低氧条件下增殖水平检测:将低氧培养箱或低氧模拟药物处理后的RPE1 vector和E7细胞用PI染色固定后行流式细胞术（Flow cytometry）,检测细胞周期变化;将低氧处理后的细胞加BrdU标记2 h,流式检测S期细胞所占比例。2.宫颈癌细胞中E7蛋白在细胞低氧抵抗中的作用2.1 siRNA选用策略:在HPV-16中,E6与E7由同一个双顺反子转录而来,共用同一个启动子和同一个早期多腺苷酸化位点,单纯靶向E7的siRNA（siRNA198）也会同时抑制E6的表达。因此,本研究采用已报道的siRNA198（siE6E7）来同时沉默E6和E7,siRNA209 （siE6）特异性干扰E6。siE6作为siE6E7的对照干扰来研究E7的功能。2.2低氧下CaSki细胞中干扰E7检测细胞周期变化:在宫颈癌CaSki细胞中用RNAi干扰HPV-16 E6E7或E6,通过蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测p53和Rb蛋白、RT-qPCR方法检测E6、E7mRNA表达水平,以验证干扰准确性和效率。采取1.4所述方法检测细胞周期以及S期细胞差异。3.低氧下E7表达细胞中细胞周期相关蛋白的表达检测:RPE1 E7和RPE1 vector细胞低氧处理后WB检测HIF-1α,细胞周期相关蛋白（Cdk1,Cdk2,Cdk4, Cdk6）及相关蛋白激酶、激酶抑制蛋白（p53, p21,p27）的变化,同时RT-qPCR检测关键蛋白mRNA水平变化。4.低氧下HPV-16 E7表达细胞差异蛋白的鉴定及Cdc6目标蛋白的验证4.1低氧下E7表达细胞与vector细胞差异蛋白分析:采用非标记质谱蛋白定量技术鉴定DFO处理后RPE1 E7和RPE1 vector细胞的蛋白表达差异。4.2蛋白聚类分析及目标蛋白的验证:以1.75倍差异作为截点对差异蛋白以进行保留。GO分析（GO enrichment analysis）差异蛋白并以生物学功能进行分类。选择Cdc6为目标蛋白,WB验证其在E7表达细胞中的上调表达,同时行RT-qPCR检测其mRNA水平变化。5.低氧下Cdc6调控HPV-16 E7细胞越过G1期阻滞的作用及机制研究5.1低氧下Cdc6在E7表达细胞低氧抵抗中的作用:RNAi技术干扰E7细胞中Cdc6的表达至vector细胞水平,WB和RT-qPCR检测干扰效果及效率。RPE1 E7表达细胞转染3 nM siCdc6后行低氧诱导处理,流式细胞术检测细胞周期;BrdU标记实验检测细胞增殖水平。分析低氧下Cdc6表达与细胞G1/S期转换之间的关系。5.2低氧下Cdc6调控E7表达细胞越过G1期阻滞的机制研究:RNAi干扰E7表达细胞中Cdc6至vector细胞水平,WB检测Cdc6蛋白表达变化对细胞周期相关蛋白的影响。采用免疫共沉淀技术（Co-IP）检测低氧条件下E7表达细胞中p21与Cdk1蛋白的结合水平,siCdc6敲低Cdc6表达后进一步检测p21与Cdk1的结合水平,探究Cdc6表达对两者结合能力的影响。研究结果:1. HPV-16 E7表达细胞能越过低氧导致的G1期阻滞:CCK8实验结果表明,低氧处理后,虽然RPE1 E7和RPE1 vector细胞活力均有降低,但与vector细胞相比E7细胞活力相对较高,其差异在100～200 μM DFO, 0.4～0.6 mM CoCl2处显著且具有统计学意义。细胞周期检测结果表明,虽然在低氧下Vector与E7细胞均出现了 G1期阻滞,但与vector细胞相比,E7细胞G1期细胞比例较少（为65.1%）,而vector细胞则高达74.5%。低氧下vector细胞比E7细胞表现出更高的阻滞水平,说明E7蛋白的存在能帮助细胞越过低氧导致的G1期阻滞。BrdU实验结果显示,低氧处理后E7细胞和vector细胞中S期比例分别为30.33%和16.15%,差异显著。低氧下E7细胞的S期比例显著高于vector细胞,说明HPV-16 E7表达细胞能够更多地越过低氧导致的G1阻滞,进入DNA复制的S期。2.低氧下敲低宫颈癌细胞中E7蛋白表达导致G1期阻滞:宫颈癌CaSki细胞含有600多个HPV-16拷贝。在CaSki细胞中干扰E6E7或E6后,Rb或p53蛋白表达增加,E6、E7表达水平降低说明干扰实验成功。流式细胞术检测结果显示,在低氧下虽然细胞均表现出低氧诱导的增殖抑制,但与CaSki-siE6细胞（G1期比例为65.1%）相比,CaSki-siE6E7细胞表现出更显著的G1期阻滞（G1期比例为80.3%）,两组相比差异显著,说明低氧下敲低E7表达的宫颈癌细胞表现出更多G1期阻滞,进一步验证了低氧下HPV-16 E7能够帮助宫颈癌细胞越过G1期检验点,促进细胞增殖。BrdU标记实验显示,低氧下CaSki-siE6E7与CaSki-siE6细胞中S期比例降低,分别为4.1%与7.8%,两者有统计学差异。敲低E7表达可使宫颈癌细胞进入S期的细胞比例明显减少,说明HPV-16 E7促进了宫颈癌细胞低氧下G1/S期转换。3.低氧下HPV-16 E7表达细胞中细胞周期相关蛋白的表达检测:RPE1 E7与RPE1 vector细胞经过药物DFO处理和低氧培养箱处理后WB检测低氧下相关细胞周期蛋白表达变化,HIF-1α表达升高说明低氧条件的成功。结果发现vector细胞中p53、p21、p27蛋白水平增高,E7表达细胞中三种蛋白表达水平无较大差异。Cdk1、Cdk2随着低氧时间增加表达降低,但在E7表达细胞中水平较高。RT-qPCR结果显示低氧下Cdk1与Cdk2在E7表达细胞中有较高转录水平。4.低氧下HPV-16 E7细胞中差异蛋白鉴定及关键蛋白Cdc6的验证:非标记质谱蛋白定量技术分析DFO低氧处理后RPE1 E7和RPE1 vector细胞的蛋白表达差异,发现有182个差异表达蛋白,其中99个蛋白在E7表达细胞中上调,83个蛋白下调。GO聚类分析显示差异蛋白生物学功能分布于大分子复合物组装,蛋白翻译,细胞极性,损伤修复,氧化还原,DNA复制等过程。质谱分析发现,在低氧条件下E7表达细胞中Cdc6蛋白上调并通过WB验证。RT-qPCR检测结果显示低氧下E7细胞中Cdc6转录水平更高。5. Cdc6促进E7表达细胞越过低氧导致的G1期阻滞:使用RNAi技术研究Cdc6是否在E7细胞低氧抵抗中发挥作用。部分敲除E7细胞中Cdc6的表达使其接近vector中水平,从而保证细胞周期完整性。流式结果显示,低氧下E7-siCdc6组G1期细胞比例为74.2%,而对照组细胞仅为63.9%,具有统计学意义。BrdU标记实验显示,低氧下,E7-siCdc6组S期比例降低为5.43%,,而E7-siCon组S期比例为19.12%,两组差异显著。低氧下干扰Cdc6表达使E7细胞进入S期细胞数量减少。以上结果证明Cdc6促进E7细胞越过低氧导致的G1期阻滞,而且此作用不依赖于Cdc6的DNA复制起始功能。6.低氧下Cdc6促进p21结合的Cdk1的释放:进一步探究Cdc6促进E7细胞越过低氧所致G1期阻滞的可能机制。我们近期研究首次发现,Cdk1可帮助E7细胞越过DNA损伤所致的G1期阻滞。因此,我们探讨了低氧下Cdc6对于E7细胞中Cdk1表达的影响。WB结果显示,E7表达细胞干扰Cdc6后,p53,p21以及Cdk2、Cdk1变化均不明显,说明Cdc6本身不能直接影响细胞周期相关蛋白的表达。进一步采用Co-IP实验检测干扰Cdc6后E7细胞中p27与Cdk1的结合能力。结果显示,常氧下与E7-siCon组相比,E7-siCdc6组细胞内p21与Cdk1结合水平大致不变。但在低氧下,E7-siCdc6组细胞中与p21结合的Cdk1比例更高,约为E7-siCon对照组的三倍,差异显著。干扰Cdc6后E7细胞中p21与Cdk1的结合能力增强,说明Cdc6在低氧下能促进E7细胞中被p21结合的Cdk1释放。较高水平的Cdk1在某种程度上推动了细胞周期进程。研究结论与意义:1.发现HPV-16 E7蛋白可促进宫颈癌细胞和E7表达细胞越过低氧所致的G1期阻滞,证明低氧条件下E7蛋白可调控细胞G1/S期转换,促进细胞异常增殖。2.通过质谱技术发现低氧下HPV-16 E7表达细胞中Cdc6表达上调并进行了验证。3.低氧下敲低E7细胞中Cdc6蛋白表达至vector细胞水平,发现Cdc6可促进E7细胞越过低氧所致G1期阻滞,Cdc6在G1/S期转换过程中必不可少且此作用不依赖于其DNA复制起始功能。4.机制研究表明,低氧下Cdc6促进E7细胞释放p21结合的Cdk1有助于推动细胞周期进程,导致细胞周期紊乱。综上,本研究揭示了 Cdc6调控宫颈癌细胞G1/S期转换的一个新功能,即在低氧状态下,Cdc6参与了 HPV-16E7蛋白诱导的细胞周期紊乱。此发现有助于深入阐明HPV E7蛋白的致癌机制,为发现宫颈癌治疗的新靶点提供实验依据。第二部分:新式HPV-16病毒整合位点检测方法的建立研究目的:口咽鳞状细胞癌（Oropharyngeal squamous cell carcinoma,OPSCC）属于头颈癌的一种,与人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染密切相关,其HPV阳性率高于80%。据流行病学调查,OPSCC多发于拥有多个性伴侣,更多口腔性行为的年轻人群。尽管目前头颈癌全球发病率有降低趋势,但口咽癌的发病率却显著升高。因此,深入探究口咽癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和防治方法非常重要。人乳头瘤病毒是一类小的DNA环状病毒,根据临床致病程度分可为高危型和低危型,高危型HPV的早期蛋白E6、E7与肿瘤发生密不可分。除可以降解重要抑癌分子p53和pRb之外,E6、E7还可以与细胞内其他蛋白结合,激活端粒酶活性,使人原代上皮细胞永生化等。但E6、E7并不能直接使细胞恶性转化,它们进一步诱发的基因组行为与肿瘤发生发展更加密切。HPV的感染和整合加剧了基因组不稳定性,E6、E7的存在使抑癌基因,以及病毒整合位点相邻基因的突变率增高是导致细胞癌变的关键因素。基因组不稳定性增强是肿瘤发展的重要标志,其主要形式是多倍体的形成,随后导致非整倍体细胞的出现。持续的高危型HPV感染导致宿主DNA损伤程度增加,通过破坏微管,激活纺锤体组装检验点等行为导致细胞多倍体形成。因此,全面检测HPV在口咽癌中的整合位点,分析HPV各基因整合频率,组合多样性等,对深入研究HPV对口咽肿瘤发展机制以及临床治疗具有重要的指导意义。早期HPV检测多采用分子生物学检测手段,如聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）等。在假定HPV的整合会导致早期基因E2在宿主染色体中缺失的前提下,通过设计特异性引物检测HPV E6, E2的表达比例来确定当前HPV处于游离或整合状态。随着新技术的出现,基于分子杂交的SPF-LiPA,基于核酸的APOT等分析相继涌现,这些技术可以特异性结合并部分扩增病毒整合位点相邻片段来得到宿主基因组整合信息。但上述方法在探针设计上局限性强,只能检测少量HPV类型,不能很好地分析临床上HPV感染情况,且检测方法存在偏倚性。近年来,随着高通量测序技术（Next generation sequencing,NGS）的迅速发展,很多基于此技术的HPV检测方法被建立起来。2015年,华大基因团队采取全基因组测序方法,在104个人宫颈癌样本和5株细胞系中全面地进行了 HPV在人类基因组整合位点的研究。此方法覆盖面广,偏倚性低,但耗时较长,且花费巨大,在研究模型转换方面并不灵活,不利于技术的普及以及个体化病人信息的提取和检测。为解决这些难题,我们创新性地建立了一项基于PCR的DNA高通量测序技术,利用96孔板快速构建DNA文库,通过对HPV基因组的针对性测序发现HPV在宿主基因组的整合位点。DNA来源除培养细胞系外,还包括福尔马林固定,石蜡包埋（Formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）的口咽癌标本。此方法取材小,时间短,灵敏度高,适用广泛,推广性强,能够为外源DNA掺入等相关基础研究提供良好的检测方法,为临床精准治疗提供可靠基础。研究方法:1 口咽癌FFPE样本中HPV阳性率的检测1.1 口咽癌FFPE样本中提取RNA:实验所选口咽癌样本皆为p16免疫组化染色阳性（p16在临床中常用来预测HPV阳性的癌症）。使用基于QIAGEN石蜡切片RNA提取的标准操作方法在免疫组化p16阳性的美国口咽癌患者FFPE标本中提取RNA。1.2特异性HPV引物设计:根据已发表文章,使用针对HPV 16型,18型,31型,33型35型,39型,45型,52型,56型,58型,59型,66型与68型早期基因E6,E7特异性引物进行HPV筛查。GAPDH和β-actin作为实验对照。1.3 HPV筛查模板的准备:在384孔板中,每个样品分32孔进行HPV水平筛查,每板12个样品。将上述引物用TE buffer稀释到0.5 μM,每孔5μL。将备好引物的384孔板放到真空抽干机中处理1小时（直到每孔液体不可见）,放入-20℃储存。1.4实时定量PCR检测口咽癌FFPE样本中HPV表达水平:将石蜡包埋样品中提取的RNA反转录成cDNA,将cDNA放入已备好的HPV筛查模板中,进一步通过RT-qPCR方法检测样本中HPV类型及表达水平。2新式DNA测序技术的建立以及在口咽癌中检测HPV整合位点的应用2.1 口咽癌FFPE样本中提取DNA:使用基于QIAGEN石蜡切片DNA提取的标准操作方法在HPV-16阳性美国口咽癌患者FFPE标本中提取DNA。2.2基于Illumina测序平台,针对HPV-16基因组的引物设计:本技术采用双向测序方法,设计两个index序列,一个molecular index序列。Adapter部分序列与Illumina测序平台OligoA相同,通过连接引入到DNA文库中,OligoB序列通过PCR过程引入。在HPV基因组引物设计方面,我们用Perl语言编写程序,在HPV-16型基因组7900多个碱基中,依以下原则进行引物设计:a,长度为21到25个碱基;b,Tm值在61.5℃到63℃之间;c,GC含量在40%到60%之间;d,高复杂性,无重复序列;e,无自身互补序列。最终针对HPV正义链和反义链两个方向各选择19个引物,同向引物相隔400左右碱基数,双向引物每条相隔200左右碱基数,完整、全面地覆盖HPV-16基因组全长。2.3新式测序方法在口咽癌细胞系中的实施和优化:以HPV-16阳性的宫颈癌细胞系CaSki作对照,在口咽鳞状细胞癌UM-SCC-47 （含有HPV-16型基因组）中建立方法,通过测序进行检测和优化。实验优化内容主要包括a,初始DNA用量对结果的影响;b,连接体系的确定;c,两步法或一步法PCR条件可行性以及对结果的影响;d,PCR体系及条件的确定。2.4 口咽癌FFPE样本DNA文库的构建和HPV整合位点的检测:利用上述口咽癌细胞系所建立的新式DNA文库准备方法和测序方法,将口咽癌样本DNA根据index1和index2分组,使用MiSeq进行双向测序,数据读取方式为2 x 250碱基。3测序数据的处理与输出数据分析需要经过三个部分:原始数据的读取,数据处理以及数据输出。使用Perl语言程序书写三个脚本并独立运行。3.1原始数据地处理:使用脚本一运行程序。主要包括:a,舍弃读取不完全,或有明显读取错误的数据;b,剪掉测序引物序列,剩下目的序列,可分析DNA文库质量和测序质量;c,将所读序列聚类分析。测序时数据虽双向读取,但每个簇共用同一个名字。因此,聚类分析后可得到每个读数上下游信息,中间以10个“L”连接,并进行下一步分析。3.2测序数据与HPV-16基因组的比对:使用脚本二运行程序。将上述所得数据与HPV-16基因组进行比对,最小长度限定为30个碱基。为了全面寻找读数中HPV-16序列,将每个读数以1-30, 2-31,3-32的方式与HPV-16序列进行比对,舍弃匹配不足30碱基的序列,输出文件。3.3 HPV-16阳性的测序数据与人基因组序列的比对:使用脚本三运行程序。将上述筛选所得数据与每个染色体基因信息进行比对,同样设定最小限度为30个碱基。将读数以1-30, 2-31, 3-32的方式与每条染色体信息逐一比对,舍弃匹配不足30碱基的序列,输出文件。研究结果:1. p16阳性口咽癌患者中HPV阳性率高于90%: 口咽癌FFPE样本提取的RNA质量满足HPV筛选的要求。在135例口咽癌样本（免疫组化p16阳性）中,通过HPV基因表达谱（HPV profiling）方法同时筛查13种常见高危型HPV,结果发现122例患者HPV阳性（阳性率为90.4%）。其中115例患者为HPV-16型阳性,3例患者为HPV-18型阳性,3例患者为HPV-33型阳性,1例为HPV-59型阳性,HPV阴性患者为13例。蛋白p16表达与HPV阳性率密切相关。选择HPV-16型阳性的患者样本进行下一步测序研究。2. HPV整合位点检测模型成功建立并在口咽癌患者样本中应用:口咽癌HPV-16阳性的FFPE样本DNA质量满足Illumina平台测序的要求。以CaSki为阳性对照,293T细胞作为阴性对照,在口咽癌细胞系UM-SCC-47中成功建立起满足测序条件的DNA文库,通过测序并以TP63基因举例展示分析方法。将此实验模型运用到102个HPV-16型阳性的口咽癌样本中进行测序,以样本0450R₀461F为例展示测序读取数据分析、DNA文库质量分析以及HPV-16整合位点所在宿主基因位置。将本方法与目前靶向测序、全基因组测序技术作了比较,体现出其方便、快捷的特点,填补了口咽癌患者基因组HPV-16病毒整合研究的空白。研究结论与意义:1.本研究首次使用HPV基因表达谱方法同时检测了 口咽癌患者石蜡包埋样本中13种常见高危型HPV,发现所选p16阳性样本HPV阳性率为90.4%,其中HPV-16型所占比例最高,为所有样本的85.2%。除此之外,HPV 18型,33型和59型也均有发现。本方法对临床口咽癌病人,乃至头颈癌、宫颈癌病人HPV筛查提供了准确、有效的手段。2.本研究建立了一个新式HPV-16病毒整合位点的检测方法。通过在96孔板中快速构建DNA文库,利用Multiplex PCR技术特异性扩增HPV-16全部基因组,进行测序并分析口咽癌中HPV病毒整合位点。本方法创新性强,耗时短,对样本质量要求宽容,且可应用于各种外源基因组整合率和整合位点的检测。对口咽癌病人,乃至其他病人的临床治疗提供了技术和理论支持。综上,本研究建立了一个新式基于PCR的HPV-16病毒整合位点检测方法。进一步研究将深入分析HPV-16在口咽癌患者基因组中的整合几率及整合特点,以及比较HPV感染在宫颈癌和口咽癌中的异同,通过详细研究被整合基因的生物学功能深入挖掘HPV导致口咽癌发生发展的更多线索。