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目的:侵袭与转移是肿瘤的恶性生物学特性之一,同时也是导致患者复发及死亡的主要原因。大量研究证明:肿瘤侵袭转移是多因素、多步骤相互作用的过程,不仅取决于肿瘤细胞自身的生物学行为,而且与其所处的肿瘤微环境密切相关。鉴于传统平面培养(two dimensional,2D)模型在模拟在体肿瘤微环境时存在巨大缺陷,本研究拟采用组织工程三维(three dimensional,3D)培养技术,体外构建理想的肿瘤3D培养模型,并基于该研究模型对培养体系内的肿瘤细胞进行基本表型及侵袭转移特性的表征,以期为深入解析肿瘤侵袭转移的发生、发展及阐明其分子机制提供理想的研究工具。方法:将侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7&MDA-MB-231(MDB-231)及人卵巢癌细胞株OV-NC&OV-206分别接种于I型鼠尾胶原支架,对照2D培养体系,体外构建肿瘤细胞3D培养模型。应用倒置相差显微镜对胶原中的细胞进行基本形态学观察;CCK-8检测及Live/Dead染色法评价肿瘤细胞的增殖能力及活性状态;同时应用苏木素/伊红(H&E)及whole-mount染色技术对细胞生长形态进行组织学评价;采用扫描电镜(SEM)观察3D培养体系内细胞团的超微结构;在此基础上,进一步对培养体系内的肿瘤细胞的侵袭转移特性进行表征:采用划痕及Transwell实验检测肿瘤细胞的迁移及侵袭生物学特性。应用实时定量PCR技术和Western blotting技术检测各实验组内基质金属蛋白酶家族(MMPs)及上皮间质转化(EMT)相关基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及Wnt5b等m RNA的表达水平和MMP-9、MMP-10、E-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平。为了进一步考察基质细胞对肿瘤细胞侵袭转移性状的影响,分别标记乳腺癌细胞(MCF7&MDB-231)和人成纤维细胞(HSF),接种于胶原3D模型中共培养。利用前述检测技术对其进行基本形态学评价,并对照单一培养体系(不含HSF培养组)重点考察共培养体系内肿瘤细胞侵袭转移相关标记物基因水平的表达情况,对肿瘤细胞-基质细胞之间的相互作用进行初步探索。结果:不同于2D培养的单层贴附生长状态,肿瘤细胞在胶原3D培养体系内,与体内实体肿瘤生长方式相似,呈现成团生长,且细胞增殖及活性良好。通过划痕实验及Transwell实验发现肿瘤细胞经胶原3D培养后迁移及侵袭能力增强。其中MDB-231经胶原3D培养后穿过Transwell小室的数量较2D培养显著增加(细胞数量:230±18 v.s 370±23)。侵袭转移相关基因和蛋白的表达水平结果显示:经胶原3D培养后,关键蛋白酶MMPs家族基因(mmp-2、mmp-9、mmp-10)的m RNA转录表达水平升高,其中卵巢癌细胞内mmp-2及mmp-9基因的表达水平的变化最为显著;而乳腺癌细胞内mmp-3及mmp-10的基因的表达水平的升高最为显著;MMP-9和MMP-10的蛋白表达水平与基因表达水平一致,在经胶原3D培养后的肿瘤细胞(包括卵巢癌和乳腺癌)中均有不同程度的高表达:其中MDB-231 3D培养组内MMP-10蛋白表达水平显著高于2D培养组(2Dv.s3D高表达3倍)。此外EMT相关通路的主要转录因子及标记物经胶原3D培养后的表达水平均有改变:其中肿瘤细胞的E-cadherin基因的表达水平下降,而N-cadherin、Vimentin及EMT信号通路的主要转录因子的表达水平经3D培养后显著升高。将乳腺癌细胞和成纤维细胞在胶原中直接共培养后,通过基因检测发现,与单独3D培养组相比,共培养组侵袭转移相关基因表达水平增高,提示基质细胞对乳腺癌细胞的侵袭转移能力可能存在一定的促进效应。结论:本课题应用组织工程三维培养技术成功构建了基于胶原水凝胶的人肿瘤细胞(卵巢癌、乳腺癌)3D(共)培养模型。该模型体系可在一定程度上克服传统肿瘤平面培养模型在模拟在体肿瘤微环境方面的缺陷,实现微环境因素的部分体外构建与模拟,从而更为真实的再现在体肿瘤细胞的生物学行为,尤其是其侵袭转移这一复杂的生物学特性。该模型将可能为肿瘤侵袭转移的深入研究提供更为理想的研究体系,也将可能应用于抗肿瘤侵袭转移药物研发的体外筛选与评价。