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近年来,药物性肝损伤的发生率在世界范围内呈上升趋势,醋氨酚(APAP)又称对乙酰氨基酚,其过量使用已成为引起急性药物性肝损伤的主要原因之一,因此研究APAP诱导的药物性肝损伤机制具有重要意义。谷胱甘肽-S-转移酶A1(GSTA1)是II相药物代谢酶,能促进谷胱甘肽与有毒代谢物结合并排出体外,提高机体抗氧化能力。肝细胞核因子-1(HNF-1)是肝脏特异性转录蛋白的成员之一,对于肝脏生长发育水平和代谢过程起重要调节作用。c-Jun-末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要组成部分,主要参与细胞凋亡的信号转导,并且对细胞炎症、生长、分化具有重要的调节作用。本研究是在APAP诱导的肝损伤模型上,进一步确定JNK信号通路与HNF-1和GSTA1在药物性肝损伤中的作用,为研究肝损伤机制及新药研发提供坚实的理论依据。本试验首先以175 mg·kg-~1的APAP溶液给小鼠灌胃,通过检测血清转氨酶(ALT、AST)活性复制小鼠药物性肝损伤模型。将40只小鼠随机分为8组,即对照组、APAP模型组、C2-神经酰胺+APAP组(共3组,C2-神经酰胺剂量分别为274 mg·kg-~1、342 mg·kg-~1、410 mg·kg-~1)、奥替普拉+APAP组(共3组,奥替普拉剂量分别为318 mg·kg-~1、340 mg·kg-~1、362 mg·kg-~1)。通过测定血清转氨酶活性筛选出C2-神经酰胺和奥替普拉最适作用剂量。将50只小鼠随机分为10组,即对照组、APAP模型组、C2-神经酰胺+APAP组、奥替普拉+APAP组、SP600125+C2-神经酰胺+APAP组(共3组)、SP600125+奥替普拉+APAP组(共3组),SP600125剂量分别为2 mg·kg-~1、3 mg·kg-~1、4 mg·kg-~1,通过测定血清转氨酶活性筛选出SP600125最适作用剂量。在此基础上,将40只小鼠随机分为8组,即对照组、SP600125组、APAP模型组、APAP+SP600125组、APAP+C2-神经酰胺组、APAP+奥替普拉组、APAP+SP600125+C2-神经酰胺组、APAP+SP600125+奥替普拉组。检测血清转氨酶活性与肝指标SOD、GSH、GSH-Px及MDA水平;通过H&E染色法进行病理组织学分析;通过Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡情况;应用Real-time PCR方法检测肝组织HNF-1和GSTA1m RNA的相对表达情况;应用Western blot方法检测肝组织中HNF-1和GSTA1蛋白表达水平,以及JNK信号通路相关蛋白与凋亡相关蛋白的表达水平。研究结果表明:(1)确定410 mg·kg-~1为C2-神经酰胺的最适作用剂量,340 mg·kg-~1为奥替普拉的最适作用剂量,3 mg·kg-~1为SP600125的最适作用剂量。(2)模型组与对照组相比,转氨酶活性极显著升高(p<0.01);与模型组相比,APAP+C2-神经酰胺组转氨酶活性极显著升高(p<0.01),APAP+奥替普拉组转氨酶活性极显著降低(p<0.01);在肝损伤基础上加入SP600125后转氨酶活性极显著降低(p<0.01);其他肝损伤指标均呈极显著变化(p<0.01)。在光学显微镜下可见,模型组肝细胞出现结构破裂、炎性细胞浸润、肝索模糊不齐,APAP+C2-神经酰胺组细胞损坏更严重,APAP+SP600125+C2-神经酰胺组细胞损伤情况改善,其他组情况与对照组相似。在荧光显微镜下可见,模型组出现细胞凋亡,APAP+C2-神经酰胺组细胞凋亡更为严重,APAP+SP600125+C2-神经酰胺组细胞凋亡情况得到改善;其他组与对照组相似。综上所述,在APAP诱导肝损伤模型基础上,C2-神经酰胺能够加重肝脏损伤,奥替普拉或SP600125均能够减轻肝脏损伤。(3)当APAP诱导肝脏损伤时GSTA1和HNF-1的m RNA及蛋白表达均极显著低于对照组(p<0.01);加入C2-神经酰胺后GSTA1和HNF-1的m RNA及蛋白表达均极显著降低(p<0.01),加入奥替普拉或抑制剂后GSTA1和HNF-1的m RNA及蛋白表达均极显著升高(p<0.01);同时应用C2-神经酰胺和SP600125,GSTA1和HNF-1的m RNA及蛋白表达均极显著升高(p<0.01)。以上研究表明,C2-神经酰胺和奥替普拉可以调节HNF-1表达,GSTA1表达的变化趋势与HNF-1相同。在肝损伤的基础上加入SP600125后HNF-1和GSTA1表达升高,肝损伤程度减轻。(4)本实验中检测了JNK和磷酸化JNK(p-JNK)、c-Jun和磷酸化c-Jun(p-c-Jun)、Bax和Caspase-3的蛋白相对表达量。当APAP诱导肝脏损伤时p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun表达极显著高于对照组(p<0.01);加入C2-神经酰胺后p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun表达均极显著升高(p<0.01),加入奥替普拉或SP600125后p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun表达均极显著降低(p<0.01);同时应用C2-神经酰胺和SP600125,p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun表达均极显著降低(p<0.01)。上述研究表明,肝损伤时JNK信号通路被激活,下游底物磷酸化增多,凋亡细胞增多;当JNK信号通路激活被抑制时,下游底物磷酸化减少,凋亡细胞减少,肝脏损伤程度降低。本研究在复制APAP诱导的药物性肝损伤模型基础上,确定SP600125、C2-神经酰胺和奥替普拉的最适作用剂量。在APAP诱导的肝损伤中,通过应用C2-神经酰胺和奥替普拉表明了HNF-1对GSTA1表达具有正向调节作用。肝损伤时JNK信号通路被激活,应用SP600125后JNK信号通路激活被抑制,同时HNF-1和GSTA1表达升高,肝损伤程度减轻。因此,JNK信号通路与HNF-1和GSTA1均参与了APAP诱导的药物性肝损伤,HNF-1表达与GSTA1表达呈正相关,JNK信号通路激活与HNF-1和GSTA1表达呈负相关。