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目的:Ph染色体阴性的经典骨髓增殖性肿瘤(MPN)以红系、粒系和巨核系中一系或多系髓细胞过度增殖为主要特征,是一种恶性血液肿瘤疾病。临床上主要以真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)多见。目前,研究证实MPN的主要分子病因包括JAK2、MPL和CALR基因突变,在MPN疾病中相互排斥发生。其中,JAK2基因突变见于95%的PV患者,突变类型主要为JAK2 V617F和JAK2 exon12。MPLW515是最常见的MPL基因突变类型,仅见于1%-10%的ET和PMF患者。CALR基因的突变热点位于9号外显子,主要表现为两种突变类型(52-bp缺失和5-bp插入),主要见于ET和PMF患者。其余未检测到上述三种驱动基因主要热点突变的MPN称为“三阴性”MPN(TN-MPN),主要见于15%的ET和低于10%的PMF患者。近年来,研究者在少数MPN患者中发现了驱动基因双突变的患者,以JAK2 V617F和CALR基因共突变多见,可见于PV、ET及PMF患者。临床工作中我们首次发现JAK2 exonl2(JAK2 N533S不典型突变)和CALR(52-bp缺失)基因共突变的一例ET患者。到目前,几乎所有的JAK2 exon12突变主要导致PV的发生,几乎没有致ET和PMF患者的报道。然而,我们收集的该例患者仅有ET表型的临床特征而缺乏PV表型,无法解释JAK2 exon12(JAK2 N533S不典型突变)克隆细胞为何未发生PV表型。本研究拟对该例患者进行JAK2N533S和CALR typel型(52-bp缺失)共突变的克隆关系分析以及JAK2 N533S突变促细胞自主增殖功能进行分析,以期阐明该患者ET发生的机制,亦为增加我们对MPN驱动突变基因功能机制的认识。方法:1.临床水平分析患者JAK2 N533S和CALR type Ⅰ型共突变的克隆关系根据赫尔辛基宣言,该患者已签署书面知情同意书。提取患者新鲜外周血单个核细胞并稀释制备单细胞悬液(1×102cells/mL),用有限稀释法培养获取单细胞克隆,挑取单细胞克隆,分别用含3U/ml rhEPO和100ng/ml rhG-CSF的甲基纤维素培养基培养单细胞克隆15天,诱导形成红系集落(BFU-E)和粒系集落(CFU-G);提取单个红系和粒系集落的DNA,用相应引物对JAK2 exon12和CALR exon 9进行PCR扩增,然后取扩增产物测序,对测序结果进行分析。2、细胞水平分析JAK2 N533S突变基因的促细胞自主增殖功能构建JAK2 N533S及其对照基因的慢病毒表达载体,通过慢病毒表达系统将JAK2 N533S及其对照基因转入BaF3细胞,建立稳定表达各载体的BaF3细胞模型;用细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测各组BaF3细胞在无IL-3条件下0-5天内的增殖情况,并统计分析。收集JAK2 N533S及其对照基因各组的BaF3细胞,提取各组细胞总蛋白并进行蛋白定量,Simple Western法分析各组磷酸化STAT3、STAT5和非磷酸化STAT3、STAT5蛋白表达水平。结果:1、本例患者初诊时的相关临床资料该患者为75岁女性患者,以“3年来血小板逐渐增多”就诊我院,无脾大、出血、血栓形成等临床表现。血常规检查:血小板707×109/L,白细胞6.8×109/L,红细胞4.26×1012/L,血红蛋白132g/L;血生化:乳酸脱氢酶297U/L;骨髓象:骨髓细胞中红系及粒系形态及比例正常,巨核细胞数量明显增多;骨髓组织活检显示:巨核细胞明显增生,无明显纤维化;染色体核型分析显示:46,XX(20个中期细胞);MPN相关基因突变检测:JAK2 exon12(JAK2 N533S)和CALR突变(CALR type1)阳性。综合上述检查结果,初步诊断该患者为ET。2、本例患者BFU-E和CFU-G集落JAK2 N533S和CALR type1型突变克隆演变分析①显微镜下挑取的17个单个红系集落,经检测全部携带JAK2 N533S杂合突变,14个(82%)集落携带CALR type1杂合突变,2个(12%)集落为CALR野生型,1个(6%)集落检测到CALR type1纯合突变。②挑取的21个单个粒系集落,经检测均存在JAK2N533S杂合突变,20个(95%)集落携带CALR type1杂合突变,1个(5%)集落为CALR野生型。③由于所有集落中均检测出JAK2 N533S杂合突变,我们推测该突变可能是胚系突变。因此,我们对该患者的毛囊DNA中JAK2N533S及CALR突变进行检测,结果发现JAK2 N533S杂合突变仍为阳性,而CALR基因为野生型,从而验证了JAK2 N533S突变为胚系突变。3、JAK2 N533S 及其对照基因(JAK2 WT,JAK2 K539L、JAK2N542-543del)的功能分析①各组Ba/F3细胞模型增殖能力分析与比较采用CCK-8法检测各组在无IL-3条件下0-5天内Ba/F3细胞的增殖情况,结果显示JAK2 N533S组和阴性对照各组细胞(JAK2 WT组、MSCV组及Ba/F3组)均未出现明显的细胞增殖,各组间细胞数无显著差异(P>0.05);JAK2 N533S与阳性各对照组(JAK2 K539L组和JAK2 N542-543del组)相比,差异有统计学意义(P<0.001)上述结果提示JAK2 N533S突变无促细胞增殖的作用。②各组Ba/F3细胞模型JAK2/STAT信号转导通路活化情况在无IL-3的情况下培养48h后进行Simple Western法分析,发现JAK2 K539L组和JAK2 N542-543del组作为阳性对照组,磷酸化STAT5(tyr694)和STAT3(tyr705)表达水平明显增加,而JAK2 N533S组与阴性对照各组(JAK2 WT组、MSCV组和Ba/F3组),STAT5和STAT3蛋白磷酸化水平均无明显表达,提示JAK2 N533S突变并不能改变JAK2蛋白的功能激活JAK2/STAT通路。结论:我们发现一例JAK2 exon 12(N533S)和CALR type1共突变的ET患者。克隆分析毛囊基因检测结果证实JAK2 exon 12(N533S)不典型突变为胚系突变,CALR type1为后天获得性突变。细胞功能研究证实JAK2胚系不典型突变(JAK2 N533S)不具有自主促细胞增殖的作用。综上提示患者携带的JAK2 exon 12(N533S)突变不具有产生PV表型的能力,而其ET表型则由后期获得性的CALR type1突变所致。