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目的糖尿病大血管病变是2型糖尿病最常见的慢性并发症之一,是糖尿病患者致死致残的主要原因。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是糖尿病大血管病变基本的病理改变,以炎症、内皮损伤和平滑肌细胞增生、迁移为早期主要特征。组织蛋白酶S(Cathepsin S,Cat S)是一种蛋白水解酶,近年来有研究表明它是AS形成过程中降解细胞外基质(Extracellular membrane,ECM)的主要蛋白酶,对AS的形成和发展起到重要作用。本研究通过观察糖尿病模型大鼠主动脉Cat S表达,以及α-硫辛酸对其表达的作用和对大鼠氧化应激状态的影响,进一步认识糖尿病AS的发病机制,探索糖尿病AS早期防治的途径。方法(1)21只SD雄性大鼠随机分为正常组9只和链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型组12只,4周后取其主动脉,HE染色,光镜下观察其形态,并用基因芯片技术分析Cat S mRNA的表达。(2)健康雄性Wistar大鼠(对照组)和自发性糖尿病模型大鼠(Goto-Kakisaki,GK)(糖尿病组)各5只,均喂养高脂饲料,12周后麻醉大鼠,取主动脉下段2～3cm主动脉,置于10%中性福尔马林液中固定,常规石蜡包埋后切片(2.5μm),进行HE染色,采用免疫组化方法观察Cat S、Mac、SMC、RECA、NFκB及iNOS的表达。(3)健康雄性Wistar大鼠5只作为正常对照组,自发性糖尿病模型大鼠(GK)随机分为糖尿病对照组5只和硫辛酸治疗组6只,均予高脂饮食,治疗组隔日1次腹腔注射α-硫辛酸35mg/KgBW,其它2组注射等剂量生理盐水,12周后麻醉大鼠,立即分离主动脉,剥离外膜,取约1mm~3动脉组织置于戊二醛中冲洗,固定,利用透射电镜技术进行超微结构观察。其余动脉组织PBS冲洗管腔,放入冻存管中投入液氮保存,然后进行总RNA提取及荧光定量逆转录-聚合酶链反应(SYBR Green quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,SYBRGreen RT-PCR)来观察Cat S及NADPH氧化酶亚基p47 phox的表达,同时测定血清MDA、SOD、GSH水平。结果(1)STZ诱导的糖尿病大鼠4周时主动脉组织形态学上未见到明显的改变,但Cat S基因表达较对照组明显上调。(2)12周光镜下对照组和糖尿病组大鼠(GK)动脉壁皆无明显动脉粥样硬化改变,糖尿病组大鼠可见细胞外基质增多,内皮不连续等异常改变。免疫组化染色提示对照组和糖尿病组大鼠均无Cat S和Mac表达;SMC actin染色可见中膜及内膜层SMC排列规则,内膜SMC未见增生;糖尿病组大鼠RECA染色可见内皮细胞出现缺损,排列不连续,内膜下未见染色,糖尿病组大鼠主动脉内皮NF-κB和iNOS表达明显较对照组增强。(3)荧光定量RT-PCR测定显示,Cat S mRNA水平在糖尿病对照组表达较正常对照组升高(P=0.001),在α-硫辛酸治疗组Cat S mRNA水平与糖尿病组相比降低但无统计学差异(P=0.071)。糖尿病对照组大鼠p47phox表达与正常对照组相比稍增高(P=0.862),α-硫辛酸治疗组p47phox表达较糖尿病对照组及正常对照组均降低(P=0.164,P=0.155),三组表达均无统计学意义。透射电镜见三组大鼠皆无明显超微结构改变。12周糖尿病组大鼠血清MDA水平明显高于,SOD和GSH水平明显低于正常对照组,而硫辛酸治疗后血清MDA水平明显低于糖尿病对照组,SOD和GSH水平明显高于糖尿病对照组。结论短期高糖导致各种基因的异常表达先于组织形态学变化,其中Cat S基因表现为异常增高。在进一步对GK大鼠的研究中,长期喂养高脂饮食无明显动脉粥样硬化形成的情况下,Cat S mRNA水平在正常组及糖尿病组之间已经有所差别,糖尿病组表达较对照组升高,但其蛋白水平在动脉壁中表达两组皆呈阴性,可能由于其表达量较低,免疫组化方法灵敏度不够导致。这似乎提示,Cat S可能并不是动脉粥样硬化病变形成的主要起始因子,而是在血管病变起始后加速它的发展,而在此时,炎症因子NF-κB和iNOS在动脉壁中已有所表达。α-硫辛酸能够改善2型糖尿病整体和局部的氧化应激状态,但对Cat S的表达无明显影响。最后,关于进一步工作的方向进行了简要的讨论。