目的：建立耐MTX骨肉瘤U20S细胞系和耐MTX结肠癌HT29细胞系，了解恶性肿瘤细胞对MTX产生耐药的生物特性和耐药机制。　　方法：通过MTX浓度梯度递增的方法建立耐MTX骨肉瘤U20S细胞系和耐MTX结肠癌HT29细胞系。耐药过程中用普通光学显微镜观察细胞形态学变化；然后利用MTT方法，检测耐药细胞的耐药指数并绘制细胞的生长曲线；分别应用Real-time PCR和Western Boltting方法比较亲本细胞系和耐药细胞系中DHFR基因在DNA、mRNA以及蛋白水平上的差异；制备细胞的中期染色体标本，对细胞进行核型分析，用普通光学显微镜观察是否有双微体(double minutechromosomes，DMs)产生：结合FISH技术观察DHFR基因扩增形式。　　结果：成功建立耐MTX骨肉瘤U20S细胞系和耐MTX结肠癌HT29细胞系。HT29耐药细胞对MTX的IC50值以及耐药指数随药物浓度的升高而增高。生长曲线结果显示U2OS和HT29耐药细胞随着耐药浓度的升高耐药细胞的增殖能力逐渐减弱。两组细胞系都表现出随着耐药浓度的升高DHFR的DNA、mRNA和蛋白表达水平逐渐增加。在耐MTX的U2OS细胞系中，各耐药水平细胞的DHFR主要以均质染色区(homogeneously stained region，HSR)形式扩增，仅在U2OS/MTX3×10-6M细胞中，有少量DMs出现。在耐MTX的HT29细胞系中，HT29/MTX10-7M、HT29/MTX10-6M、HT29/MTX10-5M细胞的DHFR主要以HSR形式扩增，而在HT29/MTX10-4M中发现大量DMs的产生，是DHFR的主要扩增形式。　　结论：成功建立耐MTX骨肉瘤U2OS细胞系和耐MTX结肠癌HT29细胞系。在U2OS/MTX细胞系和HT29/MTX细胞系中，DHFR表达上调可能是其对MTX耐药的机制之一。DHFR基因主要有两种扩增形式，即HSR和DMs。U2OS/MTX细胞系和HT29/MTX细胞系可以作为研究肿瘤耐药机制的实验模型，同时也可以作为研究DMs和HSR的形成转化的理想模型。