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龙眼是我们南方重要热带亚热带特产果树。本研究以龙眼胚性培养物为材料,进行龙眼种质资源离体保存研究。试验进行了龙眼胚性愈伤组织(embryogenic callus, EC)限制生长保存条件优化,限制生长保存后龙眼EC的体胚发生与植株再生,龙眼EC限制生长保存过程中可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化,龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目变异以及RAPD分析。主要研究结果如下:1.龙眼EC限制生长保存条件优化试验以红核子龙眼EC为供试材料,比较了不同浓度甘露醇、不同浓度肌醇、不同接种量、甘露醇和肌醇交互培养、不同浓度蔗糖、不同浓度琼脂、不同浓度PP333、不同盐浓度以及光质对龙眼EC生长的影响。试验结果表明:在本试验范围内,琼脂、PP333、盐浓度以及光质对龙眼EC限制生长保存影响效果不显著,而添加20g/L甘露醇、0.1 g/L的肌醇,并把接种量控制在0.1g/瓶,龙眼EC的继代周期可延长到70d左右。2.限制生长保存后龙眼EC的体胚发生与植株再生试验从保存的52份龙眼EC中,随机抽取了15个(凤梨穗、松风本II、鸡蛋本、苗翘、云本、油潭本、福眼、青壳蕉、普明庵、血丝、红核子、公妈本、立冬本、巨龙105、双孖木)离体保存的龙眼EC,对其进行体胚诱导、成熟、植株再生以及体胚苗移栽的研究,以检测离体保存的龙眼EC的体胚发生能力,同时为不同龙眼品种体胚发生提供参考。15个龙眼品种的体胚诱导研究表明:15个龙眼品种、不同蔗糖浓度、有机附加物、生长调节剂、光质对体胚发生的时间、数量以及质量在不同程度上有一定的影响,胚状体在15-35d皆先后形成,多为白色小子叶胚,分化频率为100%,形成数量从2550-13220个∕g不等;体胚成熟研究表明:15个龙眼品种、不同蔗糖浓度、有机附加物、光质对胚状体的大小、形态都存在一定的影响,胚状体多白色增大,大小在5-15mm不等;植株再生研究表明:15个龙眼品种、不同成熟时间、不同胚状体、光质对体胚萌发率以及再生苗长势影响显著,多数正常成熟体胚在15d左右就萌发,萌发率从50%-93%不等;体胚苗移栽研究表明体胚苗移栽到沙土(泥炭土:沙子=1:2)基质上,苗成活率可达83.33%。因此,限制生长保存后的15个龙眼品种EC仍保持强烈的体胚发生与植株再生能力。3.龙眼EC限制生长保存过程中可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化试验以限制生长保存的龙眼EC为材料,测定了红核子、松风本、苗翘在4种不同培养基中限制生长保存过程中的可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化。对不同龙眼品种在不同培养基保存过程中可溶性总糖、淀粉的变化研究表明:龙眼不同基因型以及不同培养基限制生长保存过程中总糖含量变化都有所不同。红核子与苗翘在A、B培养基中,出现积累高峰较C、D培养基早,且红核子在D培养基中、苗翘在C、D培养基中出现3次积累高峰。松风本在A、D培养基中只有1次积累高峰,而在B、C培养基中有两次积累高峰;龙眼同一基因型在不同培养基限制生长保存过程中淀粉含量有所不同,但龙眼EC限制生长保存过程中淀粉与总糖含量变化基本一致。对不同龙眼品种在不同培养基保存过程中有机酸含量的变化研究表明:龙眼EC在不同培养基限制生长保存过程中有机酸含量总体呈现下降趋势,在培养前期出现有机酸积累高峰有所不同,积累高峰的出现是有机酸的积累达到一个高度,随着培养时间的增加,EC的逐渐衰老,有机酸含量整体呈现下降趋势。4.龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目变异试验对保存的龙眼EC及其体胚发生过程中染色体数目的变异进行研究,以寻求降低变异的途径。试验结表明:胚性愈伤组织中多倍化细胞占12.4%,二倍体细胞比例为85.0%;球形胚中多倍化细胞占8.4%,二倍体细胞比例为89.4%;子叶胚中多倍化细胞占4.8%,二倍体细胞比例为94.4%;正常苗根尖多倍化细胞占2.8%,二倍体比例为96.6%。结果表明:在胚状体发生过程中,胚状体和植株中变异细胞占的比例低于EC组织中的比例,培养物多倍化细胞较缺体高,二倍体细胞比例逐步增多,表明胚状体和植株再生过程是一个对变异细胞的淘汰过程,在分化中二倍体细胞具有某种选择优势。同时试验中诱导5mo的红核子龙眼EC已经能见到染色体数目异常的细胞,变异率为8.6%,继代3a后,变异率达10.0%,且继代3a的松风本、巨龙105的染色体数目变异率也分别在9.0%、9.8%,继代13a的红核子EC染色体变异率为15.0%。表明龙眼EC的在前期变异水平变化幅度可能较大,但长期继代过程中染色体数目变异逐步趋于稳定。5.龙眼限制生长保存EC体胚发生过程及再生植株的RAPD分析利用RAPD技术从DNA分子水平对限制生长保存后的龙眼EC体胚发生过程及其体胚发生再生植株进行遗传稳定性检测。筛选了10条随机引物,对龙眼EC体胚发生过程及其体胚发生再生植株基因组DNA进行扩增。结果表明:龙眼体胚发生过程的RAPD分子标记存在一定的差异,但不同保存年份EC体胚发生过程中的相对变异率都保持在比较小的变异范围内(小于5.1 %);同时利用RAPD-PCR随机检测3个保存时间的红核子胚性培养物的再生完整植株的基因组DNA的差异,PCR扩增产物表明不同保存时间的EC再生植株之间的RAPD分子标记有差异,保存5mo的变异率为9.70%,保存3a的变异率是13.07%,保存13a的变异率是15.07%。说明同一基因型的胚性愈伤组织经长期限制生长保存后体胚再生完整植株的遗传变异频率有趋于稳定的趋势,有利于离体种质保存。