【摘 要】
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脂滴作为细胞内中性脂质的主要储存场所,对整个细胞的脂肪动态平衡起着关键的核心调控作用,脂滴功能异常往往是许多脂肪性疾病的发病原因。而高尔基体作为细胞内翻译后修饰与蛋白质分选的主要场所,对于细胞功能的正常运作非常重要。在前期的预实验中,我们发现高尔基体糖基转移酶缺失时,脂滴出现数量显著增多且聚集的情况。因此,本文拟从首次建立脂滴与高尔基体之间的细胞器互作关系为目的出发,探究高尔基体糖基化过程对脂滴功
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脂滴作为细胞内中性脂质的主要储存场所,对整个细胞的脂肪动态平衡起着关键的核心调控作用,脂滴功能异常往往是许多脂肪性疾病的发病原因。而高尔基体作为细胞内翻译后修饰与蛋白质分选的主要场所,对于细胞功能的正常运作非常重要。在前期的预实验中,我们发现高尔基体糖基转移酶缺失时,脂滴出现数量显著增多且聚集的情况。因此,本文拟从首次建立脂滴与高尔基体之间的细胞器互作关系为目的出发,探究高尔基体糖基化过程对脂滴功能的影响作用机制,并为因脂滴异常而造成的组织内脂质过量储存性疾病机理建立理论基础。首先,我们构建了高尔基体糖基转移酶复合物M-Pol I＆II亚基VAN1,MNN9,ANP1,MNN10,MNN11,HOC1的单敲除菌株,观察到在anp1?、van1?、mnn9?、mnn10?菌株中脂滴数量显著增多并发生聚集的现象,且通过梯度稀释生长实验观察到anp1?、van?、mnn9?、mnn10?菌株均出现不同程度的生长缺陷。其次,我们以anp1?和van1?作为出发菌株,通过酵母高拷贝基因文库筛选实验与差异蛋白组学分析,探寻导致这两个菌株中脂滴表型的作用蛋白分子,在候选蛋白中,通过半乳糖诱导调控表达量实验,发现Pet10p表达量上调导致脂滴也出现聚集的状态,确定Pet10p为高尔基体糖基化过程对脂滴功能影响的关键中间蛋白。最后,根据高尔基体糖基转移酶Van1p具有存在于细胞质的较长的N端尾部序列的特性,利用GST pull down实验探寻酵母细胞中van1（1-58）的互作蛋白,以此方法尝试直接建立脂滴与高尔基体之间的互作关系。通过对pull down结果的分析与定点pull down实验,我们证明了Van1p与膜泡包被蛋白AP-1复合物（包括Apl2p、Apl4p、Apm1p、Aps1p四个亚基）及PI转运蛋白Pdr17p之间存在相互作用关系,这不仅为Van1p直接参与脂质代谢提供证据,也为尚属未知的Van1p在高尔基体膜定位的机制给出了有力的提示;与此同时,这些直接相互作用蛋白的鉴定结果,对建立脂滴与高尔基体的细胞器互作关系具有全新的指导作用,亟待进一步深入探究。
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