论文部分内容阅读
目的:建立SD大鼠混合胶质细胞、C57小鼠混合胶质细胞、昆明鼠混合胶质细胞三种鼠混合胶质细胞的氧化应激模型;选择本研究中较好的一种炎症模型作为药物研究的体系,从事银杏内酯B是否对LPS介导的混合胶质细胞抗炎抗氧化作用的进行初探性研究。方法:以LPS为诱导剂,NO、IL-1β、COX-2、i NOS为抗炎抗氧化指标,并且用Greiss assay检测NO的表达,Western blot检测IL-1β、COX-2、i NOS蛋白的表达。从SD大鼠混合胶质细胞、C57小鼠混合胶质细胞、昆明鼠混合胶质细胞三种鼠混合胶质细胞中选出本次建立模型中较稳定者,进行应用性初探,即以阿司匹林作为阳性对照药,对银杏内酯B是否对LPS介导混合胶质细胞抗炎抗氧化的作用。结果:1.对三种鼠(SD大鼠、C57小鼠、昆明鼠)幼鼠断头取脑,培养混合胶质细胞,待细胞长至80%~90%融合后用免疫荧光标记星形胶质细胞的特异性蛋白GFAP验证星型胶质细胞。结果表明与前期研究一致。混合胶质细胞中,星型胶质细胞占95%~98%,培养体系正常,可用于实验。用LPS介导三种鼠的混合胶质细胞后24 h后,Greiss assay检测上清液中NO的浓度,相比较于对照组,三种鼠的LPS组的NO量均有上调趋势,且SD大鼠的LPS组释放较高浓度的NO;2.提取蛋白后,Western blot检测三种鼠IL-1β、COX-2、i NOS蛋白的表达,与空白对照组比较,三种鼠由LPS介导原代胶质细胞i NOS、COX-2和IL-1β蛋白表达明显上调。结果表明,本研究建模中LPS可以成功刺激三种鼠原代混合胶质细胞释放炎症氧化应激因子,建模成功,可用于进一步药物筛选研究,本研究以认为SD大鼠更为敏感。3.用SD大鼠原代混合胶质细胞炎症模型进行研究银杏内酯B的抗炎抗氧化作用。前者的实验结果显示阳性对照药阿司匹林在与LPS共培养12 h时,没有显示出对LPS刺激混合胶质细胞释放NO的抑制作用,而在在共培养24 h、36 h的实验中,出现明显下调NO作用;银杏内酯B与阿司匹林实验平行进行即与LPS共培养12 h后,也没有显示出对LPS刺激混合胶质细胞释放NO抑制作用,随着在共孵育时间延长至24 h、36 h后,可以显著下调NO的作用;Western blo t结果显示,i NOS、IL-1β、COX-2相应下调。4.等量银杏内酯B在加用MAPK p38子通路抑制剂(SB203580)时,与LPS共孵育,在12 h、24 h和36 h内出现时间依赖性效果,大大下调抑制LPS介导的氧化应激等分子下调。结论:1.在已建立的三种啮齿动物LPS介导的原代混合胶质细胞炎症氧化应激模型中,细胞炎症氧化应激指标如NO、i NOS、IL-1β、COX-2均上调,与我们的前期研究经典反应一致,提示建模获得成功。从建模过程和实验结果看,SD大鼠的混合胶质细胞模型,对LPS介导的炎症反应性较灵敏和稳定,因此在后续研究中选用其首先进行以银杏内酯B进行药物作用初探性研究获得成功。2.用经典的、非特异性、非甾体抗炎药阿司匹林作为阳性对照,与银杏内酯B新的作用探索性研究同时进行的平行实验中,同样使用LPS 100ng/m L分别共孵育24 h、36 h,可下调LPS诱导的SD大鼠混合胶质细胞NO的产生,反证模型成功,用药有效,也提示抗炎药可在炎症氧化应激模型中调节氧化应激,机理有待进一步研究。3.当用10μM银杏内酯B和LPS 100 ng/ml分别共孵育24 h、36 h,可下调LPS 100 ng/ml介导的SD大鼠原代混合胶质细胞NO的释放量。提示我们的初探研究中发现,银杏内酯B在细胞分子水平上有下调LPS介导的神经有在氧化应激反应作用。4.此外,基于本研究团队的其他研究结果,我们试探性使用3μM的MAPK信号传递p38子通路抑制剂与10μM银杏内酯B在SD原代和胶质细胞LPS激活模型中共孵育12 h、24 h、36 h,进行时效观察,发现MAPK信号传递p38子通路抑制剂可使同等量的银杏内酯B,其下调氧化应激分子的作用效果比其单用时的大大增强,机理有待进一步研究。