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第一部分顺铂抑制星形胶质细胞增殖的研究目的:星形胶质细胞(Astrocytes)是神经系统中分布最为广泛的一类细胞,星形胶质细胞的损伤会造成神经系统的严重损害。顺铂(Cisplatin,CDDP)是最为常见的一类化疗药物,并且具有神经毒性。本部分实验主要探讨CDDP对星形胶质细胞增殖能力的影响。方法:1.大鼠星形胶质细胞的体外培养;2.细胞按2×103的密度接种于96孔细胞培养板中,加入6.25μM、12.5 μM、25μM、50 μM、100μM的CDDP继续培养24h后,检测细胞活力;3.96孔培养板中的细胞撤去含CDDP的培养液后,改换为不含CDDP的培养液继续培养至96h、120h、144h后,再检测细胞活力;4.细胞按2×104的密度接种于24孔细胞培养板中,加入6.25 μM、12.5 μM、25μM、50μM、100 μM的CDDP继续培养24h,检测Ki67阳性细胞的比例;5.24孔培养板中的细胞撤去含CDDP的培养液后,改换为不含CDDP的培养液再继续培养至96h,检测Ki67阳性细胞的比例。结果:1.纯化后的星形胶质细胞在显微镜下进行观察检测,能够表达星形胶质细胞特异性的标记物GFAP;2.12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM CDDP处理细胞后24h,星形胶质细胞的活力明显下调;6.25μM CDDP处理细胞24后,细胞活力未明显下调;3.12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM CDDP 处理细胞后 24h,Ki67 阳性的星形胶质细胞比例明显下调;6.25 μMCDDP处理细胞24后,Ki67阳性细胞的比例未明显下调;4.撤去CDDP并继续在无CDDP的培养液中培养至96h、120h、144h后,12.5μM CDDP处理组细胞的活力下调;5.撤去CDDP并继续在无CDDP的培养液中培养至96h,12.5 μM CDDP处理组细胞中Ki67阳性细胞的比例依然低于对照组。第二部分顺铂诱导大鼠星形胶质细胞凋亡的研究目的:在第一部分的实验中,低浓度的CDDP即能够抑制细胞活力,下调细胞增殖能力。在该部分实验中,探讨CDDP对星形胶质细胞凋亡的影响。方法:1.大鼠星形胶质细胞的体外培养;2.细胞按2 X104的密度接种24孔细胞培养板中,在培养液中加入6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM、100μM的CDDP 继续培养 24h 后,TUNEL 检测细胞凋亡;3.细胞按2X104的密度接种24孔细胞培养板中,在培养液中加入6.25 μM、12.5 μM的CDDP培养24h后,撤去CDDP改换为新鲜培养液继续培养至96h、120h、144h,TUNEL检测细胞凋亡;4.细胞按2×10’的密度接种于6孔细胞培养板中,在6.25 μM、12.5 μM的CDDP培养液中培养24h后,撤去CDDP改换新鲜培养液,继续培养至96h、120h、144h后,采用流式细胞术检测凋亡细胞的数量。结果:1.在25 μM、50 μM、100 μM CDDP处理24 h后的星形胶质细胞中,TUNEL阳性的细胞数量明显增多;2.在6.25 μM、12.5 μM CDDP处理24 h后的星形胶质细胞中,TUNEL阳性的细胞数量没有明显变化;3.在撤去CDDP继续培养后,12.5 CDDP处理组星形胶质细胞中TUNEL阳性的细胞数量较对照组明显增多;4.流式细胞术检测凋亡细胞,发现在撤去CDDP并继续培养后,12.5 CDDP处理组中凋亡的星形胶质细胞比例较对照组明显增多。第三部分顺铂抑制大鼠星形胶质细胞自噬的研究目的:在前部分实验中,低浓度的CDDP能够抑制星形胶质细胞的增殖并且诱导细胞凋亡。在本部分的实验中,探讨低浓度的CDDP对星形胶质细胞自噬功能的影响。方法:1.大鼠星形胶质细胞的体外培养;2.纯化后的星形胶质细胞经CDDP处理后,提取细胞总蛋白,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、P62的表达变化;3.纯化后的星形胶质细胞按2×104的密度接种于24孔培养板中,按感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为 200 在培养孔中加入腺病毒 Ad-mRFP-GFP-LC3;4.感染Ad-mRFP-GFP-LC3的细胞经CDDP处理后,检测RFP+/GFP+(黄色)或RFP+/GFP-(红色)的颗粒数目;5.应用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine diphosphate,CQ)抑制自噬流后,检测自噬相关蛋白的变化;6.细胞经CDDP处理后,提取上清中的蛋白并定量。采用GSR-CAA-67蛋白芯片检测上清中蛋白的表达变化;7.纯化后的星形胶质细胞按2×105的密度接种于6孔培养板中,将过表达NRP2的慢病毒(LV-NRP2)和对照病毒(LV-NC)按MOI=200加入培养的细胞中,再经CDDP处理并提取蛋白,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达变化。结果:1.12.5μM CDDP处理星形胶质细胞24h后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、SQSTM1/P62、ATG5、ATG7的表达明显下调;2.腺病毒Ad-mRFP-GFP-LC3感染的星形胶质细胞用CDDP处理24h后,检测发现CDDP处理组中RFP+/GFP+的黄色斑点(即自噬体)数量明显下调,此外RFP+/GFP-的红色斑点(即自噬溶酶体)数量也明显下调;3.撤去CDDP恢复培养至96 h后,CDDP处理组中的黄色斑点和红色斑点数量依然低于对照组;4.应用自噬抑制剂CQ抑制自噬流后,再经CDDP处理24h后,CQ合用CDDP组(CQ+CDDP)的LC3-Ⅱ的水平较单用CQ组明显减少;5.应用自噬抑制剂CQ抑制自噬流后,经CDDP处理24h后,在新鲜培养液中继续培养至96h后,CQ合用CDDP组(CQ+CDDP)的LC3-Ⅱ的水平依然较单用CQ组明显减少;6.12.5 μM的CDDP处理星形胶质细胞24h,撤去CDDP继续培养至96h、120h、144h后,LC3-Ⅱ的表达水平低于对照组;7.12.5 μM的CDDP处理星形胶质细胞24h,撤去CDDP继续培养至96h、120h、144h后,ATG5、ATG7的表达水平上调至正常水平,而SQSTM1/P62的表达水平较对照组增高;8.GSR-CAA-67蛋白芯片检测12.5μM CDDP处理后培养液中蛋白的变化,结果发现Neuropilin-2(NRP2)、GAS-1、Notch-2三种蛋白的表达水平明显下降;其中NRP2的表达下调最为明显;9.星形胶质细胞过表达NRP2后,ELISA法检测发现细胞上清中NRP2表达水平上调;10.星形胶质细胞过表达NRP2后,细胞中LC3-Ⅱ的表达水平较对照组上调;此外,LV-NRP2+CDDP组LC3-Ⅱ的表达水平较LV-NC+CDDP组也明显增高。结论1.低剂量的CDDP能够抑制星形胶质细胞的活力和增殖水平;2.低剂量的CDDP能够诱导星形胶质细胞的凋亡;3.低剂量的CDDP能够抑制星形胶质细胞的自噬水平,CDDP造成的自噬功能障碍与CDDP所致的自噬相关蛋白表达下调有关;4.低剂量的CDDP能够下调NRP2蛋白的表达;而恢复NRP2的表达后,能够保护星形胶质细胞并削弱CDDP所致的自噬障碍;5.CDDP所致的星形胶质细胞增殖能力减弱、凋亡细胞数量增加、以及自噬功能的障碍,可能是CDDP所致神经系统功能障碍的主要原因。