【摘 要】
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）作为淀粉脱支酶中重要一类,能够快速水解普鲁兰糖、淀粉等糖类分子底物中α-1,6-糖苷键及α-1,4-糖苷键;它能有效对支链淀粉含量高的淀粉分子脱枝,是淀粉脱支效率的关键水解酶,属于α-淀粉酶的大家族。我们通过酶基因工程与蛋白质改造等技术,对淀粉酶的研究不断深入,进一步释放其催化功能,稳定酶理化性质。不同的普鲁兰酶与淀粉酶选配后,对应水解可得纯度高的麦芽糖、葡萄糖等
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普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）作为淀粉脱支酶中重要一类,能够快速水解普鲁兰糖、淀粉等糖类分子底物中α-1,6-糖苷键及α-1,4-糖苷键;它能有效对支链淀粉含量高的淀粉分子脱枝,是淀粉脱支效率的关键水解酶,属于α-淀粉酶的大家族。我们通过酶基因工程与蛋白质改造等技术,对淀粉酶的研究不断深入,进一步释放其催化功能,稳定酶理化性质。不同的普鲁兰酶与淀粉酶选配后,对应水解可得纯度高的麦芽糖、葡萄糖等小分子糖浆。普鲁兰酶的应用在食品、化工等领域外,也在工业制药、生物质能等领域的应用逐年扩大。同时,普鲁兰酶作为重要的淀粉脱支酶,发现新型产酶菌种,获取更优质的普鲁兰酶,依然是普鲁兰酶在淀粉脱支酶工业化应用的一大途径,对生产实用价值有重要作用。本研究在310实验室筛选一株酶活优质的普鲁兰酶菌株W310,根据16S r DNA序列分析及生理生化实验结果表明,该菌株W310为一株阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）。经设计引物扩增酶基因Pul W310,并对其酶基因Pul W310重组后,以Pul W310-PET27b为遗传载体在大肠杆菌中表达。并对该酶纯化和酶活性质研究。主要研究内容与结果如下:1、实验室经以普鲁兰糖为单一碳源的固体平板筛选,复筛后得到一株产普鲁兰酶且酶活优质菌株W310。通过对菌株W310基因序列方面进行16S r DNA序列对比分析,结合《伯杰氏细菌鉴定学手册》通过生理及生化等实验,确定该菌株为阿氏芽孢杆菌。菌株W310在LB发酵培养基,初始培养条件（35℃,180 r/min）培养24 h,发酵液比酶活为1.2 U/m L。2、我们设计引物特异性引物,通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增普鲁兰酶基因Pul W310,成功构建重组表达菌株Pul W310-PET27b-E.coli BL21（DE3）并验证,诱导产酶的比酶活为7.4 U/mg;优化重组菌株诱导发酵产酶条件,在最佳诱导条件下（诱导剂种类及浓度:0.5%乳糖;诱导温度:20℃;诱导时间:12 h）检测的比酶活达26.8 U/mg,比优化前的比酶活提高了3.6倍。3、粗酶液通过生物相容性高的Ni-NTA柱,在含250 m M咪唑的缓冲液中将目标蛋白洗脱纯化,回收率为56.6%。通过SDS-PAGE分析与酶活力检测,测定该目标蛋白分子量为116.98 k Da,电泳级纯酶的比酶活为66.93 U/mg,纯化倍数为2.49倍。酶性质研究方面,该酶的最适p H为p H 7.0,并在p H（6.5～7.5）和温度45℃以下,保持较高稳定的酶活力。同时发现部分金属离子对酶活影响有正向激活,如:1 mmo L/L的金属离子(Li+、Ba2+、Na+、Li+、K﹢),其中Ba2+对Pul W310的酶活正向激活达128%。在研究该普鲁兰酶Pul W310对普鲁兰糖、糊精等底物的水解活性实验中。Pul W310水解普鲁兰糖的产物主要为麦芽三糖;除此之外,Pul W310水解糊精的还包括麦芽糖与葡萄糖等糖,说明该酶是普鲁兰酶Ⅱ型酶。
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