基于Allo-SCT后CMV感染特异性CD8+T细胞分离纯化的实验研究

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目的:巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)感染是同种异体干细胞移植术后主要的并发症和死亡原因,健康志愿者的CMV特异性CD8+T细胞过继性免疫治疗已用于该疾病的治疗。保持提纯后的CMV特异性CD8+T细胞的功能对实验研究和临床应用均有重要意义。运用多聚体技术可以纯化CMV特异性CD8+T细胞,但多聚体试剂可能改变CMV特异性CD8+T细胞的功能状态,进而对过继性免疫治疗产生不利影响。鉴于上述原因,探讨用于CMV特异性CD8+T细胞提纯的技术并检测该技术对提纯后的CD8+T细胞的功能影响至关重要。  方法:检测30例HLA-A2/CMV血清阳性的健康志愿者的血标本,选择其中CMV特异性CD8+T细胞含量较高的标本用于提纯实验。用多聚体技术(连锁状多聚体和四聚体)和MS磁柱技术从周围血单核细胞中提纯CMV特异性CD8+T细胞。随后,运用多参数细胞免疫表型、CFSE增殖实验和ELISPOT分析检测提纯的CMV特异性CD8+T细胞的功能,并和提纯前CMV特异性CD8+T细胞比较,了解多聚体技术对CMV特异性CD8+T细胞功能的影响。  结果:30例标本中,CMV特异性CD8+T细胞占CD8+T细胞的百分率为0.15%~4.01%,其中16(53.3%)例超过0.5%。运用连锁状多聚体技术和四聚体技术提纯的CMV特异性CD8+T细胞具有相似的纯度。提纯后,CMV特异性CD8+T细胞的纯度增加30~50倍,最高达到96.79%,这些细胞表达CD8+CD45RA+CCR7-效应T细胞。培养8天后,分别有39.8%~45.5%经过连锁状多聚体技术和四聚体技术纯化的T细胞增殖。通过ELISPOT分析发现,无论是连锁状多聚体或四聚体技术分选的CMV特异性CD8+T细胞,经过同源CD8-抗原递增细胞和CMVpp65抗原肽刺激后均分泌IFN-γ和粒酶B,而经过连锁状多聚体技术分选的CMV特异性CD8+T细胞效能更高,两种技术均可保持CMV特异性CD8+T细胞原有的细胞活性,其中,连锁状多聚体技术更具有优势。  结论:CMV特异性CD8+T细胞过继性免疫治疗是治疗CMV疾病的有效方法之一。多聚体技术和四聚体技术对提纯后的CMV特异性CD8+T细胞的功能影响没有显著的差异。两种技术均可用于CMV特异性CD8+T细胞的提纯,进而应用于过继性免疫治疗,而且连锁状多聚体技术为发展CMV特异性CD8+T细胞输注治疗开辟了新的途径。
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