番茄YABBY家族转录因子的克隆、表达模式分析及其功能研究

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YABBY蛋白家族是一种植物中所特有的转录因子,具有典型的N端C2C2型锌指结构域和C端螺旋环螺旋YABBY保守结构域,在大多数的高等植物的生长发育以及形态建成方面发挥着重要的生物学功能。目前,该家族基因在模式生物拟南芥中的功能研究比较清楚,但在番茄中分子机制仍不是很清楚,研究YABBY家族基因在番茄生长发育进程中的生物学功能具有重要意义。本研究筛选了番茄YABBY家族中的几个紧密相关的转录因子分别命名为SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a,利用qRT-PCR技术研究了此三个基因在番茄各组织中的表达模式分析;在ABA、ASA、IAA、GA3等外源激素处理以及低温、高盐和叶伤害等逆境胁迫下的表达分析。此外,分别构建了SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的沉默表达载体,以及SlYABBY2a超表达载体,通过农杆菌转化的方法分别将SlYABBY1b和SlYABBY2a所构建的沉默载体和超表达载体转入番茄基因组中,经抗生素筛选以及PCR鉴定,获得相应的番茄转基因株系,并对转基因番茄的生长发育进行了表型观察,进行了相关基因的表达研究,对其功能进行初步分析。主要研究内容和结果如下:1从NCBI数据库中分别获得SlYABBY5(GenBank登录号:AK246138)、SlYABBY1b(GenBank登录号:AK326840)和SlYABBY2a(GenBank登录号:AK328263)基因序列及其所编码的氨基酸残基,并利用RT-PCR的方法克隆了包含完整ORF的SlYABBY5基因,克隆了用于构建沉默载体的SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的特异片段和用于构建超表达载体的包含完整ORF的SlYABBY2a的基因。所获得的基因片段分别连入pGEM-T-easy-vector克隆载体,经PCR验证和测序验证,所克隆的基因片段序列正确。2提取野生型番茄AC++各组织材料以及rin和Nr突变体的果实材料的总RNA,采用反转录酶和寡聚dT合成cDNA第一链。利用qRT-PCR的方法进行AC++野生型番茄各组织表达模式分析,利用Nr和rin的果实成熟突变体进行果实成熟各时期表达模式分析。结果表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a均在番茄根和茎中表达量极低,但在番茄叶组织、果实组织、萼片和花组织中均呈现组成型表达,在不同组织中的表达有明显的差异;在Nr和rin果实成熟突变体中与野生型番茄相比无明显差异,且具有类似的表达趋势。3选取四周大小的野生型番茄叶组织为材料,利用IAA、ABA、GA3和ASA等激素处理番茄幼苗,qRT-PCR方法分析表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a三个基因的表达均受到抑制;利用低温、高盐和机械损伤等处理幼苗,SlYABBY1b基因的表达也受到了明显的抑制;而SlYABBY5和SlYABBY2a基因受低温胁迫的抑制,而其表达水平受高盐和叶伤害胁迫的诱导。4利用所克隆的SlYABBY1b基因的特异序列构建了RNAi介导的番茄pBIN19::SlYABBY1b沉默载体,经PCR和酶切验证正确后,利用农杆菌介导的方法将沉默载体重组入番茄基因组中,经过Kan抗性筛选以及PCR验证的方法来筛选阳性转基因株系,经过验证获得了5个阳性的转基因株系;利用qRT-PCR技术,检测SlYABBY1b基因在所筛选出的所有的转基因株系中的表达情况,检测到该基因的表达水平均被明显的下调。5利用所克隆的SlYABBY2a的特异基因片段构建RNAi介导的番茄pBIN19::SlYABBY2a沉默载体,利用所克隆的包含完整ORF的SlYABBY2a的特异片段构建pBI121::SlYABBY2a超表达载体,经酶切和PCR验证正确后,利用农杆菌介导的方法侵染番茄子叶,分别将沉默和超表达载体重组入番茄基因组,采用Kan抗性筛选和PCR验证的方法筛选出阳性转基因株系,验证分别获得了2个超表达和5个沉默的转基因株系;利用qRT-PCR技术检测SlYABBY2a基因分别在超表达和沉默转基因株系中的表达量,结果显示,在2个超表达转基因株系中SlYABBY2a基因的表达水平均被明显上调,而该基因在沉默转基因株系中其表达量明显下降。6利用SlYABBY1b部分转基因材料分别进行生长素途径和赤霉素合成途径相关基因的检测,研究表明,IAA3、IAA9、ARF7、ARF8和PIN4在RNAi介导的沉默转基因番茄中表达水平与野生型番茄相比均被下调。其中,IAA3、IAA9和ARF8的表达在转基因株系RNAi2#中被下调的水平比RNAi4#株系明显。氧化酶基因GA20ox1的表达水平在RNAi2#和RNAi4#株系中被上调,而GA20ox2的表达水平无明显差异,但GA20ox3、GA3ox1和GA3ox2的表达水平在RNAi2#和RNAi4#中均被下调。
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