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背景与目的： 胞内钙信号与很多生理过程密切相关。胰腺腺泡细胞钙振荡是胞内钙信号的一种典型表现形式,为胞内钙信号研究的常用模型,与胰液的分泌和胰腺炎的发病机制有密切关系。本研究根据课题组的现有条件,参考有关文献,在合作研究组(美国Barrow神经学研究所吴杰教授研究组)的帮助下,利用激光共聚焦显微镜(laser confocal microscope)和微量灌流给药系统,成功建立了乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)诱发的胰腺腺泡细胞钙振荡(calcium oscillations in pancreatic acinar cells)的成像研究方法。以此为基础,本研究进一步探讨了Ach诱发的胰腺腺泡细胞钙振荡的信号转导特点、去敏感化现象和剂量效应,另外也观察了咖啡因(caffeine,Caf)对胰腺腺泡细胞钙振荡的影响,以更深入系统地了解钙振荡的特征和相关机制。 材料与方法： 选用3-4周的成年昆明小鼠,雌雄不限;麻醉处死后,打开腹腔,取出胰脏;用胶原酶消化7-8分钟,取上清,机械吹打,离心2次,去上清,加适量标准液成胰腺腺泡细胞液;用移液枪取适量腺泡细胞液于培养皿中,fluo4-AM染色,Ach等药物通过微量灌流系统按一定的时间次序作用于细胞上,利用激光共聚焦显微镜实时记录此过程中的胞内钙信号变化。实验所获得的图像数据经综合使用多种软件处理后,可获得各个有效细胞的平均钙释放量、钙振荡频率、钙振荡延时等参数;最后对所得参数分组进行统计分析,以明确钙振荡的基本特点。 结果：与结论： 1.在我们的实验系统中,Ach(400nM)可较稳定地引起胰腺腺泡细胞产生钙振荡:平均钙释放量为1.41±0.02(F/F0),钙振荡频率为0.053±0.001Hz,n=99。该反应可被阿托品(1μM)完全阻断。此结果表明我们已成功建成胰腺腺泡细胞钙振荡的成像研究方法,而且我们观察到的钙振荡是通过M受体起作用的。 2.乙酰胆碱(Ach)的去敏感化分析:对于同一细胞,先加入一定浓度的Ach(400nM)可引起一定幅度和频率的钙振荡,间隔一定时间后,再加入相同浓度的Ach,可发现钙振荡幅度和频率均有所降低:后一反应的平均钙释放量约为前面反应的91％±1%,钙振荡频率为95%±1%,n=19。 3.Ach的剂量效应:在一定浓度范围内(50nM~1600nM),钙振荡从无到有,平均钙释放量从弱到强,钙振荡频率从低到高(当浓度足够高如1600nM时,胞内钙信号维持在一个较高水平而不再振荡),呈现明显的剂量效应。其中,Ach(400nM)可较稳定地诱发出典型的钙振荡。 4.咖啡因(caffeine)的影响:我们测试了多个浓度Caf的效应,发现在测试过的175个细胞中,有23个细胞(占13.1%)在加1mM的Caf后钙振荡完全消失,另外152个细胞的钙振荡减弱:平均钙振荡幅度减小,频率降低。而在有钙振荡的例数中,Caf(n=152)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约1.6%,钙振荡频率减少约2.7%。发现在测试过的91个细胞中,有25个细胞(占27.5%)在加5mM的Caf后钙振荡完全消失,另外66个细胞的钙振荡减弱:平均钙振荡幅度减小,频率降低。而在有钙振荡的例数中,Caf(n=66)可使胰腺腺泡细胞的平均钙释放量减少约3.7%,钙振荡频率减少约3.6%。可见一定浓度的Caf可明显减弱胰腺腺泡细胞钙振荡。而加入10mM和20mMCaf后钙振荡完全消失。 以上结果表明:借助激光共聚焦显微镜可直观实时稳定地观察到Ach所诱发的胰腺腺泡细胞钙振荡,该钙振荡是通过M受体相关的信号转导通路起作用的,具有一定的去敏感化特点,有剂量依赖效应;本研究还证实Caf对Ach诱发的胰腺腺泡细胞钙振荡有抑制效应。 胰腺腺泡细胞钙振荡的成像研究方法的成功建立以及对钙振荡特点的较系统探讨,为课题组进一步的相关机制研究和临床相关研究(如急性胰炎模型的钙振荡研究)打下了坚实的基础。