论文部分内容阅读
植物在生物或非生物胁迫下,细胞质的铜锌超氧化物歧化酶(Copper/Zincsuperoxide dismutases,简称Cu/Zn SOD,CSD)通过超氧化物歧化酶的铜分子伴侣(Copper chaperone for superoxide dismutase,简称CCS)途径和非依赖CCS激活途径激活从而发挥抗氧化解毒作用。生物细胞内谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,简称GR)催化氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH可能将铜离子运送至SOD并使其激活,该酶可能与植物细胞质CSD的非CCS激活途径相关。本研究通过RT-PCR的方法克隆了长度为1485bp、编码495个氨基酸的巨尾桉谷胱甘肽还原酶(Gen Bank Accession Number:KU904639),该酶定位于植物细胞质。构建了p ET-Eu GR原核表达载体并建立了GR的原核表达体系:37℃,0.1m M的IPTG浓度,诱导4h时GR能够稳定表达。通过GR酶活检测表明转化菌株p ET-Eu GR的GR活性均高于对照菌株,说明外源基因的原核表达产物具有生物活性。利用荧光定量PCR技术分析巨尾桉中GR的时空表达特性,实验表明巨尾桉植株盆栽苗中,幼叶的GR表达量最大,随植株叶片逐渐衰老,其GR表达量也随之下降;在巨尾桉组培苗中,茎的GR表达量最大,其次是叶,GR在根中表达量最低。为研究GR与CSD1非CCS激活途径的关系,首先对实验室保存的p BI-e SOD转基因植株和p BD-anti-4CL-e CSD1两种转基因巨尾桉进行SOD酶活性测定,结合转基因植株的抗寒性实验结果,筛选出具代表性的转基因巨尾桉植株,利用荧光定量PCR技术研究被筛选出的转基因巨尾桉中GR、CSD1、CCS基因在低温胁迫下的表达量关系。(1)分析常温条件下、低温连续处理36h、48h后,耐寒能力强的植株其Eu GR、Eu CCS、Eu CSD的表达量较高(如P40、P41、P52),耐寒能力弱的植株其Eu GR、Eu CCS、Eu CSD的表达量较低(如P36、F44、F76),说明转基因植株的GR、CCS、CSD的表达量影响植株的抗寒能力。(2)连续低温处理后,CSD在低温下表达量先上升后下降,CCS在低温下表达量先下降后上升,GR在低温下表达量持续下降,其中抗寒性强的植株中Eu CSD增加量、Eu CCS变化量均异常显著,说明CCS、CSD与植物耐寒能力有关,但不足以证明其与寒害后转基因植株的恢复能力相关。(3)结合转基因植株SOD活性分析GR与CSD1激活途径的关联性时发现,CSD1的确能够作为抗寒因子缓解低温胁迫对植物带来的伤害,而CCS在低温处理后伴随SOD酶活力的恢复也逐渐恢复,验证了CCS与CSD的激活密切相关。(4)对于除P36植株(变化异常且抗寒能力及寒害恢复能力均弱)外的所有转基因植株而言,低温的连续处理后GR基因表达量持续下降,在4℃处理36h时其表达量显著高于CCS,初步判断GR与植物的抗寒性相关,且在低温胁迫下与其他作用因子共同参与的CSD1的非CCS激活途径可能占主导地位。