高效氯氰菊酯是一种应用广泛的拟除虫菊酯类农药,但其农药残留引发的食品和环境安全问题日益突出,引起了社会的广泛关注。微生物是决定拟除虫菊酯类农药在环境中归趋的主要因素之一,如何研究和利用这些微生物资源,充分发挥其对农药残留的降解能力,消除农药残留危害,已成为人类生产活动中的重要课题。本文在课题组前期研究基础上对高效氯氰菊酯降解菌HU-S-01(Streptomyces sp.)进行了深入研究,提取降解菌粗酶液,研究了降解酶的稳定性和最适条件;分离纯化得到了高效氯氰菊酯降解酶CMO;克隆了高效氯氰菊酯降解酶基因cmo并进行了原核表达分析;分析了降解机理;应用Discovery Studio2.0软件模拟了CMO与高效氯氰菊酯的结合,确定了CMO降解高效氯氰菊酯的关键氨基酸。主要结果如下:　　 (1)菌株HU-S-01产生的高效氯氰菊酯降解酶是一种胞内诱导酶,经25 mg/L的高效氯氰菊酯诱导培养后,酶活力可提高2.3倍。降解酶的最适pH值为7.5,最适温度为30℃。pH6.5～7.5的弱酸弱碱环境和0℃的低温有助于酶活性的稳定。金属离子Fe2+对酶具有极明显的激活作用:而Cu2+,Al3+和Ag+对酶具有抑制作用。降解酶对试验所用的几种拟除虫菊酯类农药均有明显的降解作用,其中对高效氯氰菊酯的降解率最高,达到71.36％。　　 (2)经过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、SephacrylTM S-100(16/60)凝胶柱层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化得到高效氯氰菊酯降解酶CMO,SDS-PAGE电泳检测纯化后的CMO条带单一,表观分子量约41kDa。在纯化过程中酶的比活力提高了26.1倍,酶的活性回收率为6.0％。用MALDI-TOF-MS制备CMO的肽质量指纹图谱,并进行同源性分析,结果表明CMO与Streptomyces griseoflavus Tu4000分泌的蛋白gi|256815059一致性最高,为35％。　　 (3)根据CMO的肽质量指纹图谱对比结果设计简并引物,以菌株HU-S-01的总DNA为模板,克隆得到高效氯氰菊酯降解酶基因cmo的部分片段,序列比对发现该片段与链霉菌属(Streptomyces)体内的单加氧酶相似性最高,根据cmo的部分片段及链霉菌全基因组序列信息设计引物,参考cmo的部分片段及其同源序列设计引物,以cDNA为模板,克隆获得高效氯氰菊酯降解酶基因xmo的全序列。基因全长1092bp,具有完整的开放阅读框,编码363个氨基酸残基,分子量及等电点预测表明,降解酶的理论分子量为41.38 kDa,等电点为5.4。　　 (4)高效氯氰菊酯降解酶基因cmo编码的蛋白组成中,带电氨基酸占42.66％,酸性和碱性氨基酸各占14.35％和14.33％,极性和疏水性氨基酸各占28.96％和30.67％。蛋白分子呈亲脂性,部分氨基酸表现出较强的亲水性,Gamier-Roboson法预测CMO的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠构成。　　 (5)将cmo的编码序列插入pET28a(+)载体Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,序列尾端保留终止密码子,构建了pET28a(+)-cmo的表达载体。IPTG诱导后高效氯氰菊酯降解酶基因cmo在大肠杆菌中成功表达。SDS-PAGE电泳结果表明蛋白分子量大约41kDa,主要以可溶性蛋白的形式存在,进一步降解活性测定表明在10min内可降解42.37％的高效氯氰菊酯。　　 (6)应用Discovery Studio 2.0软件同源模建了CMO的初始三维结构模型,对模型进行动力学优化后得到CMO的最优构象。利用CDOCKER对接程序进行了高效氯氰菊酯与CMO的模拟结合研究,MM-PBSA程序计算得到高效顺式氯氰菊酯和高效反式氯氰菊酯与CMO蛋白的结合能为分别为19.28kcal/mol和4.758kcal/mol。计算了活性位点中单个氨基酸残基与高效氯氰菊酯的相互作用能,确定氨基酸残基ILE43、ARG44、ARG255、TYR256和PHE47在CMO与高效氯氰菊酯的结合中起关键作用。　　 (7)通过分析重组菌株pET28a(+)-cmo对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯和间苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid,3-PBA)的降解,基本明确了降解酶CMO与高效氯氰菊酯和3-PBA的作用位点在苯环上,通过加氧反应裂解苯环催化它们降解。