研究背景和目的：动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是最常见的心、脑血管系统疾病之一，已成为现代社会影响人类健康的最大杀手之一。其中动脉血管平滑肌细胞（Vascular SmoothMuscle Cells, VSMCs）增殖和血管内膜的新生是动脉粥样硬化发生发展中的重要生物学过程。作为一个细胞周期和细胞凋亡调控中的重要分子，P53在动脉粥样硬化的发病过程中同样发挥着非常重要的作用，以往研究表明P53的缺失能够显著加速动脉粥样硬化的发生发展。众所周知，人类基因组中的可转录本超过90%，但是其中只有大约2%为蛋白编码基因。这意味着非编码RNA（Non-coding RNAs, ncRNAs）是哺乳动物转录组中的重要组成部分，在这些非编码RNA中，长度为21-23nt的微小RNA（microRNA, miRNA）已被证明在多种生物及病理学过程中发挥着重要作用。长链非编码RNA（Long Non-codingRNAs, lncRNAs）及其亚型基因间长链非编码RNA（Long intergenic non-coding RNAs，lincRNAs），这一类长度超过200nt的ncRNA,近年来亦被证明是非编码RNA中可发挥生物学功能的重要组分。众多研究结果提示在肿瘤的发生发展过程中，lncRNAs均有参与并发挥着重要作用，然而lncRNAs在心血管系统疾病中的作用却依然不十分清楚。基因间长链非编码RNA-p21,（Long intergenic non-coding RNA-p21, lincRNA-p21）在2010年被最早被鉴定出来。做为转录因子P53下游的一个靶基因，其转录受到P53的正性调控。lincNRA-p21可以通过物理结合P53辅活化子，作为P53通路中的一个重要组分参与到P53对下游基因的调控中去。还有研究表明，lincRNA-p21也可以通过与靶基因mRNA序列的直接结合，从而发挥基因调控的功能。尽管如此，lincRNA-p21的生物学功能依旧不够明确。基于以上背景，在本研究中，我们旨在通过对lincRNA-p21在动脉粥样硬化病理过程中的作用研究，进一步揭示lncRNA在心血管系统疾病中的作用及其可能的分子机制。方法：第一部分：（1）我们首先使用了ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠这一广泛使用的动脉粥样硬化基因敲除动物模型。通过高脂饮食饲养诱导动脉粥样硬化后，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的手段检测了动脉粥样硬化斑块中lincRNA-p21的表达量。（2）接下来我们使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7和人原代培养主动脉血管平滑肌细胞HA-VSMC两种细胞。通过设计合成分别针对小鼠源性（m）与人源性（h）lincRNA-p21的小干扰RNA（siRNA）,siRNA转染的手段制备lincRNA-p21基因沉默的细胞模型。基因沉默效果经qRT-PCR验证后，通过CCK8(Cell CountingKit-8),和Annexin V-FITC流式细胞凋亡染色检测细胞增殖和凋亡水平。（3）为了进一步了解lincRNA-p21调控细胞增殖凋亡的下游信号通路，我们以lincRNA-p21基因沉默的HA-VSMC为模型进行了高通量RNA微阵列（mRNAarray）芯片检测，芯片结果所示的下游信号通路分子表达变化使用qRT-PCR以及蛋白印记实验（Western Blot，WB）加以验证。第二部分：（1）为了进一步探索lincRNA-p21调控作用的分子机制，我们使用生物信息学的手段在线预测了lincRNA-p21与小鼠双微体蛋白2（Mouse Double Minute2，MDM2）这一P53活性调控重要分子相互结合的可能性。接下来，我们通过RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）及阶段片段蛋白质体外结合实验（RNA-pulldown deletion mapping）等实验手段在小鼠RAW264.7细胞和人HA-VSMC细胞中进一步验证了该RNA-蛋白质的直接相互结合及可能结合位点。同时，通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验，我们继续验证了lincRNA-p21/MDM2复合体对p53/p300/MDM2复合物成员相互结合的可能影响。（2）接下来我们通过染色质免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）及其后续高通量DNA深度测序（ChIP-seq）的手段，进一步观察了在HA-VSMC细胞中lincRNA-p21沉默后对P53下游靶基因启动子/增强子区P53结合活性的影响。ChIP-seq的结果通过CHIP-qPCR进行了进一步验证。（3）之后，我们在HA-VSMC细胞中人工过表达外源性野生型P53同时沉默lincRNA-p21，通过对细胞增殖和凋亡水平及下游一系列靶基因表达水平的观察，进一步揭示了lincRNA-p21与P53之间的调控关系。（4）在应激状态下，P53蛋白可以被激活从而对细胞的增殖和凋亡进行调控。故我们在HA-VSMC细胞中使用了多柔比星（Doxorubicin, Dox）这一广泛使用的细胞毒性药物以介导内源性P53的激活，同时加以lincRNA-p21siRNA处理，以该处理细胞为模型通过TUNEL及Ki67细胞染色观察细胞凋亡和增殖水平的变化。之后又通过WB实验验证了P53乙酰化水平的变化。接下来，我们又通过ChIP-qPCR检测了P53下游基因启动子/增强子区对p53结合能力即P53转录活性的变化。第三部分：（1）之后为了在体内验证lincRNA-p21对AS内膜新生的影响，我们在本研究中使用了小鼠颈动脉线损伤这一动脉粥样硬化疾病小鼠模型。我们通过重组慢病毒载体（Recombinant lentivirus Vector）介导小鼠lincRNA-p21小干扰RNA(si-mlincRNA-p21)原位注射损伤区后高脂饮食诱导的方法，建立了lincRNA-p21体内局部沉默的小鼠动脉粥样硬化模型。利用这一小鼠模型，我们进一步通过组织切片的HE染色及Ki67，TUNEL染色，观察了动脉内膜的新生情况及细胞增殖凋亡水平变化。并且同时在体内通过Co-IP实验验证了lincRNA-p21对p53/p300/MDM2复合物成员相互结合的影响。（2）最后，我们通过收集冠状动脉粥样硬化性心脏病病人组及正常对照组临床动脉血管组织及外周血标本，应用qRT-PCR的实验手段检测了lincRNA-p21在上述样品中的表达变化。结果：第一部分：（1）我们发现与野生型C57BL/6J小鼠相比，lincRNA-p21在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块组织中的表达量显著降低。（2）在RAW264.7细胞和HA-VSMC细胞中沉默lincRNA-p21后，上述两种的细胞的增殖水平增加同时凋亡水平受到抑制。（3）通过高通量RNA-array检测，我们发现在HA-VSMC细胞中沉默lincRNA-p21后，有331和274个基因分别呈现出2倍以上的上、下调趋势。基因表达谱功能分析（Gene Ontology Analysis，GO analysis）结果表明下调基因主要与细胞凋亡，细胞死亡及p53信号通路等生物学过程和信号途径密切相关。然而，当我们在HA-VSMC细胞中沉默lincRNA-p21后，p53的mRNA和蛋白水平表达并没有受到影响。随后我们经过检测发现p53下游增殖凋亡密切相关分子Puma,Bax,Noxa,MDM2的mRNA和蛋白水平表达在lincRNA-p21沉默后均有不同程度的下调。反之，我们在RAW264.7细胞中人工过表达外源性全长lincRNA-p21后，上述靶分子的表达则随之升高。第二部分：（1）通过在线RNA-蛋白质结合预测软件我们得知lincRNA-p21通过其700-1500nt与MDM2蛋白的RING结构域结合的可能性达到82%。进一步的RIP及DeletionMapping实验验证表明在HA-VSMC及RAW264.7细胞中，lincRNA-p21可通过其728-2057nt区域与MDM2蛋白直接物理结合。随后通过Co-IP实验我们发现lincRNA-p21沉默后，p300与p53的结合减少但MDM2与p53的结合增加。（2）经ChIP-seq实验，我们在HA-VSMC细胞各实验组中获得了36-53（单位：百万）个测序阅读片段，且超过95%的片段经比对与人类基因组成功匹配。我们在对照siRNA处理组得到了约4800个p53可结合DNA区域,在lincRNA-p21沉默组中这些区域的数量则显著下降。随后我们发现p53下游已知基因的启动子区p53结合峰在lincRNA-p21沉默后显著降低。ChIP-qPCR进一步验证了以上实验结果。（3）外源性过表达野生型p53蛋白可以抑制HA-VSMC细胞的增殖，但同时沉默lincRNA-p21后，因p53蛋白过表达受到抑制的细胞增殖水平获得了显著回升。同样，由p53诱导的细胞凋亡在lincRNA-p21同时沉默后也受到了抑制。同时，受到外源性p53上调的p53下游基因表达水平在lincRNA-p21沉默后亦有不同程度的回落。（4） Doxorubincin处理HA-VSMC细胞可通过激活内源性p53从而诱导细胞凋亡，导致细胞数量减少。我们发现Dox处理后的HA-VSMC细胞同时给予si-lincRNA-p21沉默处理后，原本下降的细胞数量出现回升且原本受到抑制的细胞增殖水平亦有上调。同时，原本被激活的细胞凋亡则受到抑制。接下来我们发现在lincRNA-p21沉默后，原本受到Dox刺激而强烈上调的p53下游靶基因表达水平则均有不同程度的下降。我们进一步通过ChIP-qPCR检测发现Dox处理可以显著加强p53与下游基因启动子区的结合水平，但这一水平在lincRNA-p21沉默后则呈现显著下降。第三部分：（1）经重组慢病毒载体介导小鼠si-mlincRNA-p21原位注射损伤区后高脂饮食诱导的方法，我们建立了lincRNA-p21体内局部沉默的小鼠动脉粥样硬化模型。利用这一小鼠模型我们发现在lincRNA-p21体内局部沉默后，损伤区域内膜新生显著增强并且局部细胞增殖水平显著上升，凋亡水平则显著下降。与体外实验相同，在体内沉默lincRNA-p21后，p300与p53的结合减弱而MDM2与p53的结合则得以加强。同时， p53下游相关靶分子在体内lincRNA-p21沉默后亦受到抑制。（2）通过对临床病人的标本检测我们发现，相比正常对照组，lincRNA-p21在冠状动脉粥样硬化性心脏病病人组血管组织标本中的表达有超过50%的下降，在外周血标本中其表达亦有显著下调。结论：通过本研究我们得到以下结论：（1） lincRNA-p21可作为一个重要的调控分子抑制动脉粥样硬化相关细胞增殖，促进其凋亡。（2）在小鼠颈动脉线损伤模型中沉默内源性lincRNA-p21可以显著刺激损伤血管内膜新生。（3）机制方面，lincRNA-p21可以与MDM2蛋白直接结合，从而抑制p53与MDM2的结合，增加p53与p300的结合。近而增强p53的乙酰化水平，反馈性提高p53的转录活性。这一研究进一步揭示了lincRNA-p21在p53信号通路中的作用及机制，为lncRNA在心血管系统疾病中的作用提供了理论依据，并为动脉粥样硬化的临床治疗提供了可能的新靶点。