【摘 要】
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水通道蛋白家族(Aquaporin)是一个膜内嵌蛋白(MIPS)超家族,其功能是促进水分子和小分子的被动、快速跨膜转运,起到调节渗透压的作用。在哺乳动物中有13类水通道蛋白基因,而在
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水通道蛋白家族(Aquaporin)是一个膜内嵌蛋白(MIPS)超家族,其功能是促进水分子和小分子的被动、快速跨膜转运,起到调节渗透压的作用。在哺乳动物中有13类水通道蛋白基因,而在斑马鱼中有18个公认的水通道蛋白基因,其中的一部分以串联重复的形式存在。在对水通道蛋白的研究过程中AQP1基因的表达被认为与低温胁迫相关,在硬骨鱼类中AQP1基因有两个串联重复,即AQP1b基因与AQP1a基因,其中,AQP1b基因被认为进化出了新功能,参与海水鱼类对高盐环境的适应。本研究发现在低温胁迫下斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)细胞AQP1b基因相对表达水平为对照组的3.1倍(P<0.05),提示AQP1b基因可能参与了鱼类对低温环境的适应。为进一步研究低温胁迫下斑马鱼水通道蛋白(AQP1b)基因的表达调控机制,本文用低温18°C处理的ZF4细胞(实验组)和常温28°C培养的ZF4细胞(对照组)为研究对象,采用染色质免疫共沉淀-实时荧光定量(ChIP-qPCR)和DNA甲基化免疫沉淀-实时荧光定量PCR(MeDIP-qPCR)法,研究AQP1b基因启动子区域组蛋白修饰和DNA甲基化水平低温胁迫下的变化。结果:1.超声结果显示:斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)ChIP实验的超声条件:140W,工作系数5%,时间共持续20min、25min,可以获得200~1000bp且主带集中在500bp的染色质片段,超声25min时抗原免疫原性仅为20min的0.33倍,因此超声20min作为ZF4细胞系最佳超声时间。2.ChIP-qPCR结果显示:低温处理5天后AQP1b基因启动子区域激活型组蛋白修饰H3K4me3修饰水平提高3.1倍(P<0.05);而抑制型组蛋白修饰H3K27me3的修饰水平降低2.1倍(P<0.01),阴性对照IgG无明显变化。3.MeDIP-qPCR结果显示:低温处理组AQP1b基因启动子区域甲基化水平下调7.3倍(P<0.01);基因启动子区域组蛋白H3K4me3修饰通常被认为能够改变染色质结构使得转录因子更容易结合转录起始位点,从而促进基因的转录,而启动子区域组蛋白H3K27me3修饰水平通常被认为与基因的表达呈负相关。结果表明:本文探索出ZF4细胞ChIP超声破碎最佳条件,并发现低温胁迫下,ZF4细胞中AQP1b基因可能是通过改变启动子区域组蛋白修饰和DNA甲基化水平,从而提高AQP1b相对表达量。为进一步研究AQP1b基因与低温胁迫的关系奠定基础。
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